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Praktikum 2: Restriktionskartierung

Einleitung: Sequenzierung mit dem Sanger-Verfahren

Die Template-DNA

Für eine Sequenzierung muss ein Plasmid zunächst in kleine, überlappende Fragmente gespalten werden. Dieses wird in der Praxis durch eine partielle Restriktionsspaltung mit Enzymen, die eine tetramere Erkennungssequenz wie beispielsweise Sau3A (GATC) haben, erreicht. Diese Sequenz kommt häufig im Genom vor, so dass bei einer partiellen Spaltung im Idealfall Fragmente zwischen 100 und 300 Nucleotiden entstehen, die sich dann in einen Vektor einklonieren und vermehren lassen. Für die DNA-Sequenzierung nach Sanger wird die Plasmid-DNA vor der Sequenzierungsreaktion denaturiert.

Eine andere Möglichkeit, einzelsträngige DNA zu erhalten, ist die Klonierung der DNA-Fragmente in m13-Vektoren. M13 ist ein filamentöser Bakteriophage, dessen Genom im Bakterium als Doppelstrang, im Phagenkopf aber als Einzelstrang vorliegt. Allerdings können hier, aufgrund der beschränkten Größe des Phagenkopfes, nur DNA-Fragmente bis maximal 2 kb verpackt werden, so dass dieses System heute nur noch selten verwendet wird.

Die Sequenzierreaktion

In der Praxis wird bei diesem Verfahren der denaturierten, d.h. einzelsträngig vorliegenden DNA ein radioaktiv markierter Primer und DNA-Polymerase zugegeben. Ausgehend von der Bindestelle dieses Primers auf der DNA beginnt die Polymerase mit der Synthese des komplementären DNA-Stranges. Jeder der vier Parallelansätze enthält zusätzlich zu den normalen Nucleosid-triphosphaten (dTTP, dCTP, dGTP und 35S-markiertem dATP) auch ein bestimmtes 2,3'-Didesoxynucleotid-triphosphat (ddNTP), das mit bestimmter Frequenz in die DNA eingebaut wird und zum Abbruch der Synthese führt, da diesem Nucleotid die 3'-OH-Gruppe fehlt, die die Polymerase für den nächsten Kondensationsschritt benötigt.

Heute werden anstatt radioaktiv markierter Nucleosid-triphosphate mit Fluoreszenz-Farbstoffen markierte ddNTPs eingesetzt, wobei jedes ddNTP mit einem anderen Farbstoff gekoppelt ist. So können die vier Ansätze parallel in einem Reaktionsgefäß durchgeführt und spezifisch anhand der Fluoreszenz detektiert werden. Die Kettenabbruchprodukte werden dann durch eine Kapillar-Gelelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe eines Lasers zur Fluoreszenz angeregt. Jedes ddNTP fluoresziert in einer anderen Farbe, die von einem Detektor erkannt und in ein Farbsignal umgewandelt wird. Aus diesem farbigen Peakdiagramm kann dann die Abfolge der Basen bestimmt werden.

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