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Praktikum 2: Restriktionskartierung

Die DNA-Sequenzierung

Die Entwicklung leistungsfähiger, automatisierter DNA-Sequenzierungsverfahren in den letzten 20 Jahren zählt ebenso wie die Entdeckung der PCR1) zu den Meilensteinen in der Entwicklung der Gentechnologie.

Zur Sequenzierung der DNA existieren drei unterschiedliche Verfahren:

  • Die Methode nach Maxam und Gilbert (1977), die heute allerdings nicht mehr verwendet wird. Bei diesem Verfahren wird ein DNA-Fragment bevorzugt am 5'-Ende radioaktiv markiert, denaturiert und anhand eines chemischen Verfahrens basenspezifisch gespalten. (Guanin wird beispielsweise mit Dimethylsulfat methyliert und anschließend durch eine Alkalibehandlung mit Piperidin entfernt.) Die unterschiedlich langen Spaltprodukte werden dann für jede Base in einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt. Anhand des Autoradiogramms der vier Spuren lässt sich die Basensequenz ermitteln.
  • Die klassische Methode nach Sanger (1977). Diese Methode wird auch als enzymatische DNA-Sequenzierung oder als Kettenabbruch-Verfahren bezeichnet. Das Prinzip dieses Verfahrens beruht auf dem basenspezifischen Abbruch der DNA-Synthese durch die DNA-Polymerase. In vier Ansätzen ist jeweils neben dem gewöhnlich eingesetzten 2'-Desoxynucleotid-triphosphat-Gemisch aus dTTP, dCTP, dGTP und S35-markiertem dATP je auch eines der vier 2,3'-Didesoxynucleotide als Terminator zugesetzt. Diesen 2,3'-Didesoxynucleotiden fehlt die 3'-OH-Gruppe, so dass die DNA-Polymerase das nächste Nucleotid nicht mehr ankondensieren kann und die Synthese beendet. Die entstehenden Fragmente werden anhand einer Polyacrylamid-Elektrophorese aufgetrennt und im Autoradiogramm ausgewertet. Neuere Verfahren arbeiten mit Fluoreszenz-markierten Nucleosid-triphosphaten, hier werden die Fragmente im Fluoreszenz-Detektor bestimmt und anhand von farbigen Peakdiagrammen visualisiert.
  • Das Cycle-Sequencing. Das Cycle-Sequencing stellt eine Weiterentwicklung des Sanger-Verfahrens dar, es handelt sich um eine Kombination von PCR-Technologie und dem Didesoxy-Verfahren. Hierbei kommen immer mehr automatisierte DNA-Sequenzierungssysteme zum Einsatz, womit weitaus größere Mengen DNA sequenziert werden können als noch vor fünf bis zehn Jahren. Dies ermöglichte die Sequenzierung der Genome von sehr komplexen Organismen bis hin zum menschlichen Genom. Die gängigen Sequenzierungsautomaten verfügen über spezielle Laser-Detektionssysteme, daher wird ausschließlich mit fluoreszenzmarkierter DNA gearbeitet.
  • Die Pyro-Sequenzierung. Bei dieser Sequenziermethode wird zunächst ein Primer an die einzelsträngige DNA gebunden und das erste Nucleosid-triphosphat zugegeben. Passt dieses dNTP zur DNA-Sequenz und wird von der Polymerase eingebaut, entsteht Pyrophosphat als Reaktionsprodukt, das von der ATP-Sulfurylase in Anwesenheit von Adenosin-5'- phosphosulfat in ATP überführt wird. Diese ATP nutzt nur die Luciferase, um Luciferin in Oxyluciferin zu überführen und damit Licht zu produzieren, das von einer Kamera erfasst wird und als Peak in einem so genannten Pyrogramm erscheint. Das Enzym Apyrase degradiert alle nicht eingebauten dNTPs und überschüssiges ATP, bevor ein neuer Zyklus beginnt.
1)PCR: Polymerase-Kettenreaktion
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