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Praktikum 2: Restriktionskartierung

Einleitung: Restriktionsendonucleasen

Die Restriktionsenzyme zählen zu den Endonucleasen, die DNA durch Spaltung der Phosphodiester-Bindungen innerhalb der DNA-Stränge abbauen können.

Je nach Art der Erkennungs- und Schnittstelle unterscheidet man Typ I-, II- oder III-Restriktionsendonucleasen. Für die Gentechnologie sind vor allem die Typ II-Enzyme von Bedeutung, die spezifisch palindrome Sequenzen von 4-6 Nucleotiden erkennen. Die Enyzme spalten den DNA-Doppelstrang an dieser Erkennungsstelle symmetrisch oder versetzt, so dass entweder glatte (blunt ends) oder 3'- bzw. 5'-überhängenden Enden (sticky ends) entstehen.

Restriktionsendonucleasen stammen aus Bakterien und können artfremde DNA erkennen und spalten (Restriktion oder Verdau der Fremd-DNA). Die DNA der eigenen Zelle wird von diesen Enzymen nicht angegriffen, da diese durch ein spezifisches Methylierungsmuster geschützt ist. Gemeinsam mit den DNA-Methylasen bilden die Restriktionsendonucleasen das Restriktions-Modifikations-System der Bakterienzellen. Die verschiedenen Bakterienstämme besitzen jeweils eigene Modifikationssysteme und Restriktionsendonucleasen.

Die Bezeichnung der Restriktionsendonucleasen besteht jeweils aus der dreibuchstabigen Abkürzung der Bakterienspezies und dem Stamm, aus dem das Enzym isoliert wird (z.B. EcoRI für das erste aus Escherichia coli Stamm R isolierte Typ II-Restriktionsenzym).

Häufig benutze Restriktionsendonucleasen

Anwendung in der Molekularbiologie

Die Entdeckung der Restriktionsendonucleasen steht ganz am Anfang der modernen Molekularbiologie, denn mit Hilfe diese Enzyme war es erstmalig möglich, DNA-Fragmente sequenzspezifisch aus dem Genom herauszuschneiden und kompatible Fragment-Enden zu schaffen, die sich in einer Ligationsreaktion wieder verbinden lassen.

Für die meisten Anwendungen muss ein vollständiger Verdau des DNA-Moleküls durch die Restriktionsenzyme erfolgen, so z.B. bei der Restriktionskartierung. Hier beträgt die Inkubationszeit für den Spaltungsansatz, je nach Menge an DNA, mindestens 1-12 Stunden bei optimaler Reaktionstemperatur. Bei verschiedenen Klonierungsstrategien, wie z.B. dem Anlegen von Genbanken, wird allerdings auch oft der so genannte Partialverdau angewendet, also ein unvollständiger Restriktionsverdau. Durch eine deutlich verkürzte Inkubationszeit sowie eine verringerte Enzymkonzentration werden nur manche der Erkennungssequenzen gespalten. Dabei entstehen verschieden lange Restriktionsfragmente mit jeweils identischen Enden, die sich im Idealfall überlappen. So kann bei einer späteren Sequenzierung die Position und die Abfolge der einzelnen Fragmente bestimmt werden.

Abb.1
Verschiedene Restriktionsenzyme
Hinweis
Die Menge an Restriktionsenzym wird in Units (Einheiten) angegeben: Eine Unit ist die Menge an Enzym, die in einer Stunde bei optimalen Reaktionsbedingungen 1 µg DNA spaltet.
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