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Praktikum 4: Ligation und Transformation

Phosphatasen

Definition
Phosphatasen hydrolysieren Phosphomonoester-Bindungen, also beispielsweise die 5'-Phosphat-Gruppen von Nucleinsäuren, Nucleosid-monophosphaten oder Zuckerphosphaten.
Abb.1
Alkalische Phosphatase von E. coli

Die verschiedenen Phosphatasen haben sehr unterschiedliche pH-Optima, es gibt z.B. saure oder alkalische Phosphatasen. In der Gentechnologie benötigt man Phosphatasen, um endständige Phosphat-Guppen von DNA-Fragmenten zu entfernen. Dies dient als Vorbehandlung für eine radioaktive Markierung des 5'-Endes eines natürlichen DNA- oder RNA-Fragments.

Phosphatasen und Ligase-Reaktion

Eine wichtige Bedeutung liegt auch darin, die bei der Ligation von rekombinanter DNA mit Restriktionsenzymen behandelten Plasmid-Vektoren an der Monoligation (Vektorschluss ohne Insert) zu hindern. Das Produkt der Ligation mit Phosphatase-behandeltem Vektor ist ein ringförmiges Plasmid mit zwei weit voneinander entfernten nicks. Diese nicks sind Substrat für die E.coli-Ligase und werden von der Zelle repariert (zur Vergrößerung bitte das Bild anklicken).

Abb.2

Die Phosphatase-Reaktion muss bei der Durchführung einer Ligation in einer so genannten Vektorkontrolle kontrolliert werden. Hierbei wird der Phosphatase-behandelte Vektor ohne Insert-Anteil in die Ligation eingesetzt. Nur monoligierte Vektoren zeigen ein Kolonienbild auf den Selektionsplatten; die Anzahl der Kolonien lässt Rückschlüsse auf die Aktivität der verwendeten Phosphatase zu.

Hinweis
Wichtig ist bei diesen Enzymen, dass nach einer bestimmten Reaktionsdauer eine Inaktivierung erfolgt, z.B. durch Hitzeeinwirkung, um die Dephosphorylierung ausschließlich auf die Zielregion zu beschränken.
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