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Praktikum 4: Ligation und Transformation

Versuch: Ligation und Transformation

Ausgehend von einem Standardplasmid (pHK255) ohne jegliche zusätzliche Fremdgene werden, wie im Versuch Fragmentisolierung beschrieben, zwei Fragmente dieses Plasmids hergestellt und isoliert. Ein Fragment enthält den origin of replication und einen Teil des Ampicillin-Resistenzgens (= der Vektor), während das andere Fragment den Ergänzungsteil des Ampicillin-Resistenzgens (= das Insert) umfasst.

Abb.1
Ligation und Transformation

Vektor und Insert sind mit korrespondierenden Enden versehen (EcoRI - G/AATTC und BglI - GCCNNNN/NGGC) und werden durch die T4-DNA-Ligase miteinander verknüpft, so dass nach der Transformation kompetenter E. coli-Zellen (siehe kompetente Zellen) eine Selektion mit Ampicillin durchgeführt werden kann. Die Reaktion wird bei zwei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt, um den Einfluss der Temperatur auf die Ligase-Reaktion zu demonstrieren. Die anschließende Plasmidisolierung aus Ampicillin-resistenten Klonen (siehe Plasmid-DNA-Isolierung) und die Überprüfung der mit Restriktionsenzymen gespaltenen Plasmide durch eine Gelelektrophorese (siehe Agarose-Gelelektrophorese) gibt dann Aufschluss darüber, ob die Bakterien wirklich das korrekte Plasmid tragen.

Für die Auswertung werden gespaltene und ungespaltene DNA verglichen und die Banden des Standards vermessen. Die Tabellenwerte sollen anhand einer Eichkurve den Fragmenten des Markers und den Banden im Gel zugeordnet werden, indem gegen den Logarithmus der Basenpaare auf halblogarithmischem Papier die Laufstrecke in mm aufgetragen wird. Dann kann die Fragmentgröße der Plasmide und daraus die Gesamtgröße des Plasmids bestimmt werden.

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