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Praktikum 4: Ligation und Transformation

Die Substrate der Ligasen

Während die aus Escherichia coli isolierte Ligase auf beiden DNA-Strängen versetzt liegende, offene Phosphodiester-Bindungen spezifisch ligiert, führt die T4-Ligase aus dem Bakteriophagen T4 noch zusätzlich die Verknüpfung von linearen, doppelsträngigen DNA-Fragmenten ohne überhängende Einzelstrangbereiche aus, die so genannte blunt end-Ligation. Damit wird z.B. die Zirkularisierung eines linearen, doppelsträngigen Moleküls möglich. Allerdings wird für solch eine Reaktion die 30-fache Menge an Ligase benötigt.

Hinweis
Nur die DNA-Ligase aus Phagen (T4 oder T7) ermöglicht eine uneingeschränkte Kombination von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Herkunft zur Herstellung von rekombinanter DNA.
Tab.1
Substrate der DNA-Ligasen
SubstratErläuterung
Abb.1
Dieser Einzelstrangbruch (nick) kann auch von der E. coli-Ligase erkannt und repariert werden.
Abb.2
Hier kann die E. coli-Ligase bereits nicht mehr am Temperaturoptimum arbeiten, weil diese Struktur bei 37 °C bereits instabil ist.
Abb.3
Eine biotechnisch gewollte Situation, die von der Phagen-Ligase erkannt wird. Das rot eingefärbte 5'-OH gehört bei Klonierungsexperimenten zum Vektor und verhindert die Selbstligation des Vektors. Der verbleibende nick wird in der Zelle repariert.
Abb.4
Blunt end Ligation! Schwer, aber für die Phagen-Ligase immer noch machbar.
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