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Praktikum 4: Ligation und Transformation

Die Ligase-Reaktion in vitro

Bei der Ligase-Reaktion sind zwei gegensätzliche Phänomene zu beachten: Je mehr sich die Reaktionstemperatur dem Optimum bei 37 °C annähert, desto höher ist die Aktivität des E. coli-Enzyms - aber desto höher ist auch die Beweglichkeit der DNA-Enden, die diese Ligase verbinden will (Abb. 1) . Die Atmungsaktivität der DNA-Fragment-Enden ist hier der geschwindigkeitsbestimmende Faktor. Bei Temperaturen über 25 °C ist diese so stark, dass das Enzym nicht mehr in der Lage ist, effektiv an beide Fragmente zu binden, um die Verknüpfungsreaktion zu katalysieren. Bei Temperaturen unter 10 °C ist die Atmungstätigkeit der Fragmente zwar am geringsten, aber die Ligase-Aktivität ist gleichfalls stark herabgesetzt. Längere Inkuabtionszeiten können das ausgleichen, wie im zugehörigen Versuch gezeigt wird.

Faszit: Bei Klonierungsexperimenten im Labor liegt die optimale Reaktionstemperatur der Ligase-Reaktion üblicherweise bei 16 °C, oft wird die Reaktion auch über Nacht im Kühlraum durchgeführt. Die Ausbeute unterscheidet sich zumeist nicht gravierend.

Abb.1
Abb.2
Abb.3
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