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Praktikum 4: Ligation und Transformation

DNA-Ligasen

Definition
DNA-Ligasen sind Enzyme, die die Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen einer freien 5'-Phosphat-Gruppe und einer freien 3'-Hydroxy-Gruppe zweier doppelsträngiger DNA-Fragmente katalysieren.
In der Zelle katalysieren diese Enzyme die Reparatur von Einzelstrangbrüchen. In vitro verbinden die DNA-Ligasen offene Enden (sticky ends oder auch blunt ends) von DNA-Fragmenten zur Herstellung von rekombinanter DNA.
Abb.1
DNA-Ligase des Bakteriophagen T7

Bakterien besitzen im Gegensatz zu eukaryontischen Zellen nur eine DNA-Ligase. Diese benötigt NAD als Cofaktor, während die beiden verschiedenen DNA-Ligasen eukaryontischer Zelle ATP als Cofaktor verwenden. Auch die phagencodierten DNA-Ligasen brauchen ATP zur Katalyse der Verknüpfungsreaktion.

Die Verknüpfung der DNA-Fragmente läuft, unabhängig von der Natur des Cofaktors, bei den verschiedenen DNA-Ligasen über ähnliche Zwischenschritte ab:

  1. Bildung eines Enzym-Nucleotid-Intermediats durch Transfer des AMP-Anteils von NAD bzw. ATP auf die ε-Amino-Gruppe einer Lysin-Seitenkette des Enzyms.
  2. Freisetzung von Nicotinamid-monophosphat (NMN+ ) bzw. -diphosphat. Die Adenyl-Gruppe (AMP) mit dem aktivierten Phosphat wird auf die 5'-Phosphat-Gruppe des offenen DNA-Stranges übertragen, die DNA wird dabei also adenyliert. In diesem Fall ist die Adenylat-Gruppe über ein Pyrophosphat an das 5'-Nucleotid gebunden und nicht, wie bei gewöhnlichen Adenylierungen, über eine Phosphodiester-Bindung.
  3. Bildung der Phosphodiester-Bindung über den Angriff der 3'-Hydroxy-Gruppe auf das aktivierte 5'-Phosphat mit der Freisetzung des AMP-Restes und des Enzyms.
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