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Praktikum 6: LacZ-Test

Der β-Galactosidase (LacZ)-Test

Mit dem β-Galactosidase- oder LacZ-Test lässt sich der Einfluss von Regulationselementen oder die Auswirkung von Mutationen im Promotorbreich auf die Expressionsrate eines Reportergens analysieren. Reportergene codieren für Enzyme, deren Anwesenheit sich leicht nachweisen und auch quantifizieren lässt. Typische Beispiele hierfür sind Licht-produzierende Enzyme wie das GFP (green fluorescent protein) und die Luciferase, oder Enzyme, die ein farbloses Substrat in einen Farbstoff umwandeln können (z.B. β-Galactosidase und β-Glucuronidase).

Das Reportergen lacZ

Als Reportergen wird häufig das E. coli-Gen für die β-Galactosidase (Lactase, EC 3.2.1.23; lacZ) verwendet. Dieses Enzym spaltet 1,6-allo-Lactose in Glucose und Galactose, akzeptiert auch andere β-glycosidisch substituierte Galactosen als Substrat, so z.B. das hier verwendete ONPG (ortho-Nitrophenyl-galactosid).

Abb.1
Spaltung der Lactose durch das Enzym β-Galactosidase

Während ONPG selbst farblos ist, weist das Produkt der β-Galactosidase-Reaktion, ortho-Nitrophenol, eine intensiv gelbe Farbe auf. Da die Menge an gebildetem ortho-Nitrophenol pro Zeiteinheit proportional zur Menge an β-Galactosidase ist, können die Photometer-Messdaten direkt mit der Expressionsrate der β-Galactosidase korreliert werden.

Abb.2
Spaltung von ONPG durch das Enzym β-Galactosidase
Abb.3
β-Galactosidase-Test
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