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Praktikum 6: LacZ-Test

Versuchsdurchführung: lacZ-Test

Anzucht der Testkulturen und Zellaufschluss

Für diesen Versuch werden Agarplatten mit Einzelkolonien zur Verfügung gestellt, die jeweils ein auf dem Vektor pOM8 basierendes Plasmid mit einem unterschiedlichen Promotorfragment enthalten. Pro Plasmid werden zweimal (Kontrollansatz!) 2 mL Flüssigmedium im Reagenzglas steril mit einer Einzelkolonie beimpft und über Nacht bei 37 °C im Roller inkubiert.

Abb.1
Anzucht von Bakterien im Schüttelschrank
Institut für Technische Chemie, Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover

Am nächsten Morgen werden 0,5 mL der Übernachtkultur abgenommen und zu 5 mL Medium in vorbereitete 50 mL-Fläschchen gegeben. Nach 2 h Schütteln bei 37 °C ist eine optische Dichte OD600 von ca. 1 erreicht. Die Gesamtkultur wird nun in ein eisgekühltes 12 mL Polycarbonat-Röhrchen überführt, für 15 min im Eis gekühlt und für 10 min bei 4.000 rpm in der SORVALL-Kühlzentrifuge abzentrifugiert.

Der Überstand wird dekantiert. Zur vollständigen Entfernung des Überstandes bleiben die Röhrchen für wenige Minuten kopfüber auf saugfähigem Papier stehen. Das Pellet wird mit 5 mL Z-Puffer versetzt und auf dem Vortex resuspendiert.

1 mL dieser Suspension wird zur Bestimmung der OD600 in eine Plastikküvette pipettiert und bis zur späteren Messung im Photometer aufbewahrt (Medium-Standard nicht vergessen). Die restlichen 4 mL Suspension werden auf Eis gekühlt und die Zellen durch eine Ultraschall-Behandlung aufgebrochen (40 s/150 W; Gehörschutz benutzen!).

Der Enzymtest

100 µL des Lysats (Sonifikat) werden in ein 2 mL-Eppendorfgefäß überführt und mit 900 µL Z-Puffer verdünnt. Die Enzymreaktion wird nun durch Zugabe von 200 µL ONPG gestartet. Um eine vergleichbare Reaktionszeit zu erhalten, sollten diese Pipettierschritte möglichst gleichmäßig erfolgen (z.B. die Reaktion in 30-Sekunden-Intervallen starten). Nach jedem Pipettierschritt wird der Ansatz auf dem Vortext durchmischt.

Nach 3 min wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 500 µL 1 M Natriumcarbonat gestoppt. Dabei ist es wichtig, dass das Natriumcarbonat in der gleichen Reihenfolge und im gleichen zeitlichen Abstand wie zuvor das ONPG zugegeben wird, um die Reaktionszeiten für alle Proben möglichst identisch zu halten. Aber Achtung: ist schon vor Ablauf der dreiminütigen Reaktionszeit eine intensive Gelbfärbung bei einer der Proben zu beobachten, so muss der gesamte Versuch mit einer höheren Verdünnung wiederholt werden.

Nach dem Enzymtest werden die Reaktionsgefäße für 10 min in der Kühlzentrifuge bei 8.000 rpm zentrifugiert, um Messungenauigkeiten durch restliche Zelltrümmer zu vermeiden. Vom Überstand wird jeweils etwa 1 mL in eine beschriftete Kunststoff-Küvette gegeben und die OD420 gegen einen entsprechenden Standard bestimmt.

Chemikalienliste

Verwendete E. coli-Stämme mit Plasmiden

Die Auswertung

Die Auswertung erfolgt nach folgender Formel:

Aktivität [u] = OD420 x 1.000 x tmin -1 x Testvolumen -1 x OD600 -1

tmin = Reaktionszeit in Minuten

Das Testvolumen bezieht sich auf die Verdünnung des Reaktionsansatzes; einer zehnfachen Verdünnung entspricht beispielsweise ein Wert von 0,1.

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