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Praktikum 6: LacZ-Test

Der β-Galactosidase-Test

Mit diesem Test, der auf dem Einsatz des lacZ-Gens als Reportergen beruht, können einzelne Promotoren oder eine Kassette regulativer Elemente eines Operons untersucht werden. Das DNA-Fragment mit den zu untersuchenden Regulationselementen muss dabei so in den Expressionsvektor kloniert werden, dass die RNA-Polymerase von hier aus mit der Synthese der lacZ-mRNA in Transkriptionsrichtung beginnen kann.

Abb.1
LacZ-Test-Proben im Heizblock

Die β-Galactosidase dient in diesem Versuch als Reporterprotein, d.h. die Menge an Enzym, die leicht über die Umsetzung eines Substrates in einen Farbstoff bestimmten werden kann, ist ein direktes Maß für die Stärke der Genexpression vom Promotor aus. Eine derartige Versuchsanordnung wird z.B. gewählt, wenn einzelne Promotorelemente mutiert oder auch nur im Hinblick auf ihre Bedeutung für die Genexpression untersucht werden sollen, aber die Menge des natürlichen Proteins, das von diesem Promotor aus transkribiert wird, nicht ohne Weiteres messbar ist. Die β-Galactosidase lässt sich auch in eukaryontischen Systemen zur Bestimmung der Promotorstärke einsetzen, hier allerdings zumeist in Kombination mit Kontrollelementen des SV40- oder CMV (Zytomegalie-Virus)-Promotors.

Hinweis
Die Aktivität der β-Galactosidase wird anhand des artifiziellen Substrates o-Nitrophenyl-β-D-Glucopyranosid (ONPG) bestimmt. Das Enzym β-Galactosidase spaltet ONPG zu Galactose und o-Nitrophenol, das photometrisch bei 420 nm detektiert werden kann. Die Menge an o-Nitrophenol ist direkt proportional zu der Menge der in der Zelle gebildeten β-Galactosidase.
Abb.2
Spaltung von ONPG durch das Enzym β-Galactosidase
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