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Praktikum 1.2.: Isolierung genomischer DNA

Die Isolierung genomischer DNA mit Anionenaustauscher-Säulen

Für die Isolierung der zellulären DNA können auch Säulen eingesetzt werden, die kommerziell erhältlich sind und für den jeweiligen Zelltyp (z.B. Blut, Gewebe, Hefe, Pflanzenzellen oder Bakterien) optimiert wurden. Der Ablauf der Probenvorbereitung und der Zelllyse ist bei den verschiedenen Proben oft unterschiedlich, da sich die verschiedenen Zelltypen im Hinblick auf ihre Zellwand erheblich unterscheiden, während die eigentliche DNA-Isolierung immer gleich abläuft.

1. Zelllyse und enzymatisch Behandlung

Nach der Vereinzelung von Zellen bei Geweben oder Organen (Probenvorbereitung) erfolgt die Zelllyse, durch die die genomische DNA überhaupt erst zugänglich gemacht wird. Dabei wird die Zellmembran, gegebenenfalls auch die Zellwand und die Kernmembran, lysiert.

Zuerst werden die Zellen durch eine Zentrifugation pelletiert und der Medium- bzw. Pufferüberstand verworfen. Das Zellpellet wird nun in einem Zelllyse-Puffer resuspendiert, in dem sich zusätzlich RNasen wie die RNase A (Verdau von RNA), Lysozym (Lyse der Bakterienzellwand) und Proteasen wie z.B. Proteinase K (Verdau der Proteine) befinden. Der Puffer enthält zudem Detergenzien, die die Zellmembran perforieren. Bei diesen ersten Arbeitsschritten ist ein gutes Durchmischen nach jeder Enymzugabe sehr wichtig. Die Probe wird anschließend im Wasserbad inkubiert.

2. Die DNA-Isolierung unter Verwendung einer Anionenaustauscher-Säule

Nach der Lyse der Zellen erfolgt die eigentliche DNA-Isolierung, bei der die DNA von dem Gemisch aus degradierter RNA und Proteinen sowie Puffersubstanzen getrennt wird. Zuerst muss die verwendete Säule mit dem Äquilibrierungspuffer auf die Versuchsbedingungen eingestellt werden, bevor die Probe auf die Säule aufgetragen werden kann. Unter den Bedingungen des Äquilibrierungspuffers bindet DNA an das Säulenmaterial. Auf die Säule wird anschließend mehrmals ein Waschpuffer aufgetragen, mit dem alle Verunreinigungen von der Säule entfernt werden, bevor im letzten Schritt die DNA mit dem Elutionspuffer von der Säule gelöst wird.

3. Fällung der DNA aus den Eluat

Die DNA wird nun aus der wässrigen Lösung durch Zugabe von Isopropanol gefällt, mit einem Glasstab in eine anderes Gefäß überführt und im Wasserbad im Aufbewahrungspuffer gelöst. Nach diesem letzten Schritt ist die gereinigte, konzentrierte DNA bereit für weitere Untersuchungen.

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