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Praktikum 1.2.: Isolierung genomischer DNA

Die Isolierung chromosomaler DNA

Praktisch jede Zelle enthält genomische DNA1) in Form eines oder mehrerer Chromosomen, die im Cytoplasma (Prokaryonten) oder im Zellkern (Eukaryonten) lokalisiert ist; zu den wenigen Ausnahmen zählen z.B. die Erythrocyten, bei denen die Zellkerne im Laufe der Reifung degradieren.

Die chromosomale, bakterielle DNA liegt als ringförmig geschlossener Strang vor und bildet im Komplex mit den bakteriellen Nucleoproteinen ein einziges Chromosom.

Die Isolierung des Bakterienchromosoms beginnt mit dem schonenden Abbau der Bakterienzellwand durch Lysozym und der proteolytischen Zersetzung der Zellproteine durch das Enzym Proteinase K. Zur vollen Entfaltung der Aktivität benötigt dieses Enzym die Gegenwart von SDS2), das als Detergenz die Phospholipide und Proteinkomponenten der Zellmembranen solubilisiert. Die Behandlung mit Proteinase K dient insbesondere dem vollständigen Aufschluss der Nucleoproteine.

Durch mehrere Extraktionsschritte mit Phenol werden anschließend die Proteine aus dem Präparat entfernt. Phenol denaturiert die Proteine, die nach dem Ausschütteln größtenteils in der so genannten Interphase zwischen der wässrigen Nucleinsäure-Lösung und der Phenol-Phase ausfallen. Ein Teil der denaturierten Proteine liegt bereits nach dem ersten Extraktionsschritt in der Phenol-Phase gelöst vor. Um die Proteine vollständig zu entfernen, muss der Phenolisierungsschritt so lange wiederholt werden, bis keine Interphase mehr vorliegt. Im letzten Schritt wird die DNA durch eine Isopropanol-Fällung gereinigt und konzentriert.

Abb.1
Isolierung der chromosomalen DNA durch eine Phenolextraktion

Der Zellextrakt wird im Verhältnis 1:1 mit puffergesättigtem Phenol versetzt, geschüttelt und für 15-20 min zentrifugiert, um eine optimale Phasentrennung zu erreichen. Der wässerige Überstand wird vorsichtig abpipettiert, ohne die Interphase zu berühren, und der Vorgang ggf. wiederholt.

1)DNA: Desoxyribonucleinsäure
2)SDS: sodium dodecyl sulfate
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