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Praktikum 1: DNA-Isolierung

Die DNA-Isolierung: Einleitung

Neben der chromosomalen DNA besitzen viele bakterielle Zellen noch extrachromosomale, selbst-replikative Elemente, die Plasmide genannt werden. Plasmide sind oft klein, ringförmig und bestehen aus Doppelstrang-DNA. Einige Plasmide tragen keine erkennbaren genetischen Marker (kryptische Plasmide), die meisten aber codieren für Proteine, die der Zelle einen Überlebensvorteil verschafft, so z.B. für Schwermetall-, Antibiotika- und Toxin-Resistenzen, Antibiotika- und Toxin-Produktion oder den Abbau organischer Komponenten.

Plasmide können über Konjugation transferierbar sein (d.h. sie verfügen über tra- und mob-Gene, wie z.B. das F-Plasmid von E. coli), von anderen konjugativen Plasmiden mobilisiert werden (wenn sie nur die mob-Gene tragen); sie können in geringer Kopienzahl (low copy-Plasmide) oder in mehr als 100 Kopien pro Zelle vorliegen (high copy-Plasmide). Eine Bakterienzelle kann auch verschiedene Plasmide enthalten, sofern diese Plasmide nicht zur gleichen Inkompatibilitätsklasse gehören. Inkompatible Plasmide lassen sich ohne Selektionsdruck nicht gemeinsam stabil in einer Zelle etablieren, was in der Gentechnologie mitunter ein Problem darstellt, da viele der im Labor verwendeten Plasmide vom gleichen Vorläufer-Plasmid abstammen.

Die einfache Handhabung dieser kleinen genetischen Elemente im Labor, ihre hohe Kopienzahl und ihre Übertragbarkeit von Bakterium zu Bakterium macht Plasmide zu einem der wichtigsten Hilfsmittel in der Gentechnologie.

Chromsom oder Plasmid?

Praktisch jede genetische Manipulation und jede DNA-Analyse erfordert zu irgendeinem Zeitpunkt im Versuchsablauf eine Isolierung der zellulären DNA. Zu diesem Zweck müssen die Bakterien zunächst mit mechanischen, chemischen oder enzymatischen Verfahren aufgebrochen werden, bevor die DNA vom Rest des Zellextrakts abgetrennt und aufgereinigt werden kann. Abhängig davon ob die hochmolekulare, genomische DNA oder die niedermolekulare, ringförmige Plasmid-DNA isoliert werden soll, unterscheiden sich auch die Methoden für die Zelllyse und die DNA-Isolierung.

  • Der Aufschluss der Bakterienzellen zur Isolierung genomischer DNA geschieht mit schonenden enzymatischen Verfahren; üblicherweise wird eine Kombination aus Lysozym (Abbau der Zellwand) und Proteinase K (proteolytischer Abbau der Zellproteine) eingesetzt. Die eigentliche Isolierung der genomischen DNA aus dem Zellextrakt erfolgt dann durch mehrere Phenol- bzw. Phenol/Chloroform-Extraktionsschritte.
  • Bei der Gewinnung von Plasmid-DNA werden zumeist Detergenzien zum Aufbrechen der Zellen verwendet. Die wichtigste Methode ist dabei die alkalische Lyse, die eine Kombination aus Zellaufschluss und eigentlicher Isolierung der DNA darstellt. Das Verfahren macht sich die unterschiedlichen Renaturierungsgeschwindigkeiten von genomischer DNA und Plasmid-DNA zu Nutze.
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