zum Directory-modus

DNA-Reinigung über Sephadex G-50

Sephadex G-50-Säulen werden z.B. eingesetzt, um (ggf. auch radioaktive) Nucleotide und Salze von DNA-Fragmenten abzutrennen. Dazu werden 5 g Sephadex G-50 in 50 ml TE-Puffer aufgeschwemmt und autoklaviert. Als Säulen eignen sich 1.000-μl-Pipettenspitzen, die zunächst mit einem Stopfen aus silanisierter Glaswolle am unteren Ende verschlossen und dann mit Sephadex G-50 bis zum Rand gefüllt werden (ca. 1 mL). Diese Pipettenspitze wird in ein kleines Greiner-Röhrchen gestellt, für 3 min bei 3.000 rpm in der Laborfuge zentrifugiert und in ein neues, steriles Röhrchen überführt.

Nun wird die DNA-Probe, die zuvor mit bidest. Wasser auf ein Volumen von 200 μl verdünnt wurde, auf die Säule aufgetragen und erneut für 3 min bei 3.000 rpm in der Laborfuge zentrifugiert. Die DNA ist im Durchlauf der Säule enthalten, während sich Nucleotide und niedermolekulare Verunreinigungen in der Gelmatrix befinden.

Bei größeren Säulen wird nach der Equilibrierung der Gelfiltrationssäule mit dem Elutionspuffer (z.B. TE-Puffer) die DNA-Lösung auf die Säule aufgetragen und mit Elutionspuffer eluiert. Das in mehreren Faktionen gesammelte Eluat kann dann später anhand der Absorption der Lösungen bei verschiedenen Wellenlängen auf den DNA-Gehalt getestet werden. Die Spektroskopie erlaubt eine Abschätzung der DNA-Konzentration (Extinktion bei 260 nm) und der DNA-Reinheit (Verhältnis E280/E280). Mehr zur Extinktion von Nucleinsäuren finden Sie im Kapitel "Die Bestimmung der Konzentration und Reinheit von Nucleinsäuren".

Tris-EDTA (TE)-Puffer

1)Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan2)EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure