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Arbeitsprotokoll

  • 4,1 g CsCl wird in Corex-Röhrchen eingewogen und 4 mL DNA-Lösung in TE-Puffer zugegeben.
  • Nach Zugabe von 300 µl Ethidiumbromid-Lösung (5 mg/mL) wird der Ansatz vorsichtig gut durchmischt.
  • Die Corex-Röhrchen werden für 30 min bei 20.000 rpm zentrifugiert. Bei diesem Schritt setzen sich Verunreinigungen (z.B. durch Proteine) als Pellet ab oder bilden einen flockigen Film auf der Oberfläche.
  • Der Überstand wird möglichst frei von Verunreinigungen mit einer Pasteurpipette abgenommen und in Quickseal-Röhrchen gefüllt. Jeweils zwei der Quickseal-Röhrchen werden, ggf. durch Zugabe von CsCl-Lösung (4,1 g CsCL in TE-Puffer), auf der Feinwaage genau austariert, die Öffnungen werden verschweißt und die Röhrchen in den Ultrazentrifugenrotor gesetzt.
  • Die Zentrifugation erfolgt über Nacht bei 4 °C und 50.000 rpm (Rotor Vti65) im Vakuum.
  • Am nächsten Morgen kann die untere Bande, die die supercoil-Plasmid-DNA enthält, unter UV-Licht mit einer Kanüle abgezogen werden.
  • Die Plasmidfraktion wird dreimal mit CsCl-gesättigtem Isopropanol extrahiert, um das Ethidiumbromid zu entfernen, danach in sterile Dialyseschläuche gefüllt und bei 4 °C für 2 x 2 Stunden gegen jeweils 2 L TE-Puffer dialysiert.