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Arbeitsprotokoll

Detektion der Dig-Markierung (Roche Applied Science)

Die Membran wird 5 min bei Raumtemperatur auf dem Taumelrollmischer mit Maleinsäure-Puffer und daraufhin eine Stunde mit Blocking-Puffer inkubiert. Darauf folgt eine 30-minütige Inkubation mit Antikörper-Puffer. Dann wird die Membran 4 x 10 min mit Maleinsäure-Puffer gewaschen und für 5 min in Substrat-Puffer aktiviert. Im Anschluss daran wird die Membran aus der Hybridisierungsröhre entnommen und mit 10 mL Entwicklungslösung in Folie eingeschweißt.

Die Entwicklungslösung enthält das Chemolumineszenz-Substrat CDP-Star. In Anwesenheit der alkalischen Phosphatase kommt es zur Entwicklung des Chemolumineszenz-Signals.

Die Entwicklungslösung wird nach 5 min abgegossen und die Membran im Dunkeln aufbewahrt. Nach einer Stunde wird ein Röntgenfilm auf die Membran aufgelegt und je nach Stärke des Signals nach einer bestimmten Zeitspanne entwickelt. Diese bewegt sich zwischen 3 min und mehreren Stunden.