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Praktikum 3: DNA-Hybridisierung

Versuchsdurchführung: DNA-Hybridisierung

In diesem Versuchsteil werden die markierte Sonden-DNA und der Filter zunächst vorhybridisiert und dann hybridisiert.

Die Vorhybridisierung (Prähybridisierung)

Nach dem Transfer der Proteine auf die Nylon-Membran müssen zuerst die freien Bindungsstellen auf der Membran blockiert werden, da sich sonst u.U. ein Teil der markierten Sonde unspezifisch an diese Bindungstellen heften und einen erheblichen Hintergrund für die Nachweisreaktion erzeugen würde. Das Blockieren der freien Bindungsstellen erfolgt z.B. mit BSA (bovine serum albumin), Lachs- oder Heringsperma in der Prähybridisierungslösung, die (bis auf das Fehlen der Sonde) in ihrer Zusammensetzung der späteren Hybridisierungslösung entsprechen sollte. Prähybridisiert wird bei der gleichen Temperatur, bei der auch die Hybridisierung durchgeführt wird.

Für die Prähybridisierung wird die Membran in eine Hybridisierungsröhre gegeben und mit 20 mL der Prähybridisierungslösung für mindestens 1-2 bei h oder über Nacht bei Hybridisierungstemperatur (in diesem Fall 68 °C) inkubiert.

Die Hybridisierung

Für die eigentliche Hybridisierung wird die Hybridisierungslösung zunächst für 15 min aufgekocht, um die Sonde zu denaturieren, und auf Eis gekühlt. Die Prähybridisierungslösung wird abgegossen und dann die Hybridisierungslösung zu der in der Röhre befindlichen Membran gegeben.

Abb.1
Hybridisierung

In der Regel werden 2-5 mL Hybridisierungslösung eingesetzt, um die DNA-Sonde nicht zu stark zu verdünnen. Die Menge der Hybridisierungslösung hängt vor allem von der Größe der Membran und der damit verbundenen Größe des Hybridisierungsröhrchens ab; ein guter Richtwert sind mindestens 3,5 mL Hybridisierungslösung pro 100 cm2 Membran. Hybridisiert wird für mindestens 6 h bzw. über Nacht im Roller oder Schüttler bei 68 °C. Nach der Hybridisierung wird die Hybridisierungslösung abgegossen und zur weiteren Verwendung bei -20 °C aufbewahrt. Die Membran wird dann 3 x 20 min mit vorgewärmtem Waschpuffer bei 68 °C gewaschen; an diese Waschschritte schließt sich die Detektionsreaktion an.

Hinweis
Die Zusammensetzung und Temperatur des Waschpuffers bestimmt die Stringenz des Waschvorgangs. Soll weniger stringent gewaschen werden, kann dieser Schritt bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Ist der Hintergrund zu hoch, sollte mit 0,2 x SSC und 0,1 % SDS bei Hybridisierungstemperatur gewaschen werden, um die Stringenz zu erhöhen.

Puffer und Lösungen

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