zum Directory-modus

Arbeitsprotokoll

DNA-Markierung mit dem "Dig DNA Labeling Kit" (Roche Applied Science)

In der Klenow-Reaktion wird die zuvor denaturierte DNA (10 min, 95 °C) nach dem Abkühlen auf Eis mit einem Gemisch von Hexanucleotiden inkubiert, die sich an die DNA-Einzelstränge anlagern. Dadurch wird die Bindung des Klenow-Enzyms und die folgende Ergänzung zu Doppelsträngen möglich, bei der etwa alle 25-30 Nucleotidie ein DIG-markierts dUTP eingebaut wird. Die Inkubation erfolgt bei 37 °C über Nacht und ist für Fragmente mit 200-1.000 Nucleotiden optimiert. Am folgenden Tag wird das Enzym durch Zugabe von 3 µL EDTA1) (0,2 M, pH 8,0) inaktiviert, die markierte DNA einer Ethanol-Präzipitation unterzogen und in 30 µL bidest. H2O aufgenommen.

Klenow-Reaktionsansatz:

  • 1 µL denaturierte DNA (10 ng-3 µg)
  • 3 µL Hexanucleotid-Gemisch
  • 3 µL dNTP-Mix mit DIG-dUTP
  • 3 µL Klenow (2 U/µl)
  • auf 30 µL mit bidest. H2O auffüllen