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Praktikum 3: DNA-Hybridisierung

Nicht-radioaktive Markierung einer DNA-Sonde

Die DNA kann mit verschiedenen Methoden am 5'-Ende durch die Polynucleotid-Kinase oder über die ganze Länge der DNA markiert werden. Heute wird allerdings eher die vollständige Markierung gewählt, da hier die Signalstärke höher ist als bei einer Endmarkierung. Dieses kann durch eine Nick-Translation oder eine in vitro-Transkription erreicht werden. Als Label werden entweder radioaktive Nucleotide (z.B. 32P)-ATP, Biotin- oder Digoxigenin-markierte Nucleotide eingesetzt.

Abb.1
Digoxigenin-11-dUTP

Digoxigenin-11-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat, Lithiumsalz (Digoxigenin orange markiert)

Abb.2
Biotin-16-ddUTP

Biotin-16-2',3'-didesoxyuridin-5'-triphosphat, Lithiumsalz (5-[N-(N-Biotinyl-ε-aminocaproyl-γ-aminobutyryl)-3-aminoprop-1-enyl]-2',3'-didesoxyuridin-5'-triphosphat, C32H48Li4N7O17P3S, Biotin orange markiert)

  • Bei der Nick-Translation erzeugt eine milde DNase-Behandlung Einzelstrangbrüche (nicks) in der DNA, die dann von der Klenow-Polymerase mit markierten Nucleotiden aufgefüllt werden.
  • Bei der DNA-Markierung über in vitro-Transkription wird die DNA zunächst denaturiert und die einzelsträngige DNA dann mit einem kommerziell erhältlichen Hexanucleotid-Primergemisch inkubiert, die so gewählt sind, dass sie an beliebige DNAs mit einer gewissen Häufigkeit binden. Ausgehend von diesen Primern kann die DNA-Polymerase den zweiten Strang synthetisieren und baut dabei die im Reaktionsansatz ebenfalls vorhandenen markierten Nucleotide ein.
  • Die Markierung mit Digoxigenin kann auch über eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfolgen. Im Reaktionsansatz für die PCR wird der dNTP-Mix durch einen Digoxigenin-Labeling-Mix ersetzt, in dem sich z.B. Digoxigenin-markiertes dUTP befindet, das während der PCR eingebaut wird.

DNA-Sonden können auch an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt werden, der nach erfolgter Hybridisierung durch eine geeignete Lichtquelle zur Fluoreszenz anregt wird. Dieser Fluoreszenzfarbstoff wird z.B. bei einer speziellen Hybridisierungvariante, der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH) eingesetzt. Das FISH-Verfahren dient vor allem zum Nachweis von numerischen Chromosomenaberrationen (u.a. auch in der Diagnostik von Trisomien bei Risikoschwangerschaften) und strukturellen Chromosomenveränderungen wie Translokationen, Deletionen oder Amplifikationen in cytologischen Ausstrich- oder histologischen Schnittpräparaten oder in der Krebsforschung und -diagnostik eingesetzt. Eine Weiterentwicklung des FISH-Verfahrens ist der MFISH (multicolor fluorescent in situ hybridisation).

Versuch: Digoxigenin-Markierung einer DNA durch in vitro-Transkription

Bei der hier verwendeten Markierungsmethode wird ein denaturiertes DNA-Fragment in vitro mit Hexanucleotid-Primern inkubiert und durch Einbau von Digoxigenin-markiertem dUTP mit der Klenow-Polymerase markiert. Das dUTP ist über einen Spacer mit dem Steroid-Hapten Digoxigenin verbunden. Nach Hybridisierung an die Ziel-DNA werden die Hybride durch einen Enzym-gekoppelten Immunoassay (enzyme-linked immunoassay) unter Verwendung eines Antikörper-Konjugats (Anti-Digoxigenin-alkalische Phosphatase-Konjugat) und einer nachfolgenden Behandlung mit einem Chemolumineszenz-Substrat nachgewiesen.

Hinweis
Als Klenow-Fragment (nach Hans Klenow) wird die größere der beiden DNA-Polymerase I-Untereinheiten aus E. coli bezeichnet. Diese Untereinheit hat Polymerase- und 3'5'-Exonuclease-Aktivität, aber die 5'3'-Exonuclease-Aktivität fehlt. Das Enzym synthetisiert, ausgehend von einem Einzelstrangbruch oder einer Lücke in der DNA, den fehlenden Doppelstrang.

Arbeitsprotokoll

Chemikalienliste

1)EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
2)EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
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