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Praktikum 3: DNA-Hybridisierung

Blotting-Varianten

Für den Transfer von Nucleinsäuren oder Proteinen auf eine Membran können verschiedene Methoden eingesetzt werden. Bei allen Methoden müssen Agarose-Gele vor dem Blotting einer Behandlung unterzogen werden, die einen effizienten Transfer der nun einzelsträngigen Nucleinsäuren auf die Membran gewährleistet. Dazu wird die DNA im Agarose-Gel zunächst depuriniert, dann denaturiert und schießlich wieder neutralisiert, bevor der eigentliche Transfer (Blot) auf die Membran erfolgt.

Abb.1
Aufbau eines Kapillarblots
  • Beim Kapillarblotting werden die Nucleinsäuren durch Kapillarkräfte auf die Membran transportiert. Dabei wird der Blot-Puffer durch das Auflegen einer dicken Schicht Filterpapier durch das Gel und die daraufliegende Membran gesaugt. Die mittransportierten Nucleinsäuren gelangen so auf die Membran und werden dort adsorbiert bzw. fest gebunden.
  • Beim Vakuumblotting werden Nucleinsäuren durch das Anlegen eines Vakuums transferiert. Die DNA-Banden sind beim Vakuumblotting aufgrund der kürzeren Blotting-Dauer (2 h) schärfer als beim Kapillarblotting (12 h), damit wird eine bessere Auflösung erzielt.
  • Das Elektroblotting wird zum Transfer von Nucleinsäuren oder Proteinen aus Polyacrylamid-Gelen verwendet. Diese wandern durch Anlegen eines elektrischen Feldes auf die entsprechende Membran, die auf der Anodenseite angebracht ist.
Abb.2
Aufbau eines semi-dry-Proteinblots

Eine Membran (dunkelgrau) wird auf das Proteingel (braun) gelegt und zwischen mehrere Lagen saugfähigen, feuchten Papiers und Schaumstoff (schwarz) deponiert. Die Spannung wird so angelegt, dass die negativ geladenen Proteine vom Gel auf die Membran wandern. Für den Proteintransfer werden Nitrocellulose-Membranen oder die etwas widerstandsfähigeren Membranen aus Polyvinylidendifluorid (PVDF) verwendet. Der elektrophoretische Transfer erfolgt dann bei 10 V für 30 min.

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