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Vom Gen zum Protein

Replikation

Die Verdoppelung der DNA ist, wenn man manchen Schulbüchern Glauben schenkt, nach der Beschreibung der Watson-Crick-Doppelhelix ein Kinderspiel. Das bekannte Reißverschluss-System ist zwar von Watson und Crick selbst „angeregt“ worden, indem sie ihr vereinfachendes Modell publiziert haben (vgl. J. Watson „Die Doppelhelix“), aber mit der Wahrheit hat ihr Modell bestenfalls teilweise zu tun.

Richtig ist, dass die Synthese des sog. Leitstranges sehr einfach zu verstehen ist. Der „leading strand“ (Vorwärtsstrang) dient als Matrize und die DNA-Polymerase synthetisiert unter Nutzung der vier -Nucleosid-triphosphate den neuen Strang. Falsch ist, dass die gleiche DNA-Polymerase ohne jede Verzögerung den „lagging strand“ (Rückwärtsstrang) synthetisiert. Wäre dies der Fall, so würden wir eine andere DNA-Polymerase benötigen, die nun aber -Nucleosid-triphosphate verwenden müsste. Diese sind aber nicht bekannt.

Die Zelle hat einen ebenso eleganten wie komplizierten Weg gefunden, dennoch beide DNA-Stränge quasi synchron herzustellen, indem sie den „lagging strand“ diskontinuierlich aufbaut. Das geschieht mit Hilfe eines hochmolekularen oligomeren Holoenzyms, das aus mehr als 24 Proteinen besteht. Dabei bildet der „lagging strand“ stets aufs Neue eine ca. 2000 Nucleotide große Schleife. Jetzt erlauben es die sterischen Verhältnisse, beide Stränge parallel und in die gleiche Richtung zu synthetisieren.

Wegen der enormen Bedeutung zeigen wir Ihnen zunächst einmal den Aufbau des Holoenzyms in einem Tutorial. Sie können in diesem Tutorial entweder die Steuerungsleiste benutzen oder die Erklärungen mit "Mouse-over" abrufen. Sie sollten spätestens nach dem Tutorial Ihre zugehörigen Vokabeln gelernt haben. Im Anschluss zeigen wir Ihnen die mechanistischen Details des wesentlich komplizierteren Reaktionsablaufs des „lagging strand“ anhand einer Bildfolge.

3-D Modell der verschiedenen DNA-Konformationen

Bitte klicken Sie zum Abspielen des Tutorials auf das Bild!

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Abb.1
Die Enzyme der DNA-Replikation
Tab.1
SchrittErklärung
Abb.2
Jeder neue Strang, unabhängig davon, ob die Matrize ein "leading“ oder der "lagging strand“ war, beginnt mit einem RNA-Primer, der anschließend entfernt werden muss. Hier ist ein wachsendes Okazaki-Fragment gezeigt. Das DNA-Polymerase-Holoenzym befindet sich noch an dem wachsenden neuen Strang (growing strand). Der RNA-Primer (rot hervorgehoben) beginnt mit einem Triphosphat, welches aus der Synthese übrig geblieben ist. Die Lücke zwischen dem Ende des vorlaufenden Okazaki-Fragmentes und dem RNA-Primer ist nicht definiert (undefined gap).
Abb.3
Sobald das Holoenzym die jetzt doppelsträngige DNA verlassen hat, wird der RNA-Primer (rot hervorgehoben) mit Hilfe einer DNA-RNA-Hybride erkennenden Ribonuclease (RNAse, grüner Kreis) vollständig zu Ribo-Mononucleotiden abgebaut. Es wird schließlich ein 10 bis 20 Nucleotide großer Bereich einsträngiger DNA gebildet ("enlarged gap"). Das Ende des vorlaufenden Okazaki-Fragmentes bleibt von diesem Abbau unberührt. Bitte achten Sie darauf, dass es sich um das 3´-Ende eines DNA-Stranges handelt.
Abb.4
Die so geschaffene Situation, nämlich ein durchgehender DNA-Strang stabil gebunden an einen zweiter DNA-Strang mit freiem 3´-OH-Ende, ist das Substrat für die DNA-Polymerase 1. Sie ist ein typisches Reparaturenzym, weil sie nur einen Strang synthetisieren kann (vgl. DNA-Polymerase 3). Sie hängt an das freie 3´-OH solange 5´-Nucleosid-Triphosphate ("gap closing", blaue Häckchen) bis sie ermüdet. Sie kann dabei mit Hilfe ihrer 5´-3´-Exonuclease-Aktivität den vorlaufenden Strang abbauen. Auf diese Art wird die einzelsträngige DNA zum Doppelstrang ergänzt. Bitte achten Sie darauf, dass vor der Polymerase das 5´-Ende des nachfolgenden Okazaki-Fragmentes (schwarz gezeichnet) liegt. Es handelt sich um das 5´-Monophosphat eines Desoxynucleotids, also dem Produkt des RNAse-Abbaus. (Achtung: Nucleasen produzieren regelmäßig 5´-Monophosphate.)
Abb.5
Die DNA-Polymerase 1 verläßt die DNA, wenn die Lücke geschlossen ist ("gap closed“). Jetzt stehen 5´-Phosphat des ersten Nucleotids (hervorgehoben in schwarz) des nachfolgenden Okazaki-Fragmentes und das freie 3´-OH des neugeschlossenen Strangs (in blau, Detail nicht gezeigt) in unmittelbarer Nachbarschaft.
Abb.6
Dieselbe Situation ist an einer Beispielsequenz vergrößert dargestellt. 5´-Phosphat und 3´-OH sind gemäß den Regeln für die verkürzte Darstellung der DNA gezeichnet und grau unterlegt.
Abb.7
Dieselbe Situation ist hier im Detail wiedergegeben. Die unmittelbare Nachbarschaft zwischen 5´-Phosphat und 3´-OH (grau unterlegt) ist zwar sterisch gegeben, aber es kann nicht zu einer Veresterung kommen, weil das Phosphat nicht aktiviert ist. Eine wichtige Rolle bei der korrekten räumlichen Anordnung dieser auch als "nick“ bezeichneten Situation spielen die Basen der benachbarten Nucleotide. Durch Stapelwechselwirkungen ("stacking forces“) und durch Wasserstoff-Brückenbindungen werden sie in der korrekten Position gehalten.
Abb.8
Die DNA-Ligase (grün hervorgehoben) erkennt die Situation aus dem vorlaufenden Bild und hängt an das 5´-Phosphat einen 5´-Monophosphatrest des Adenosins (AMP), so dass ein gemischtes Anhydrid entsteht. Damit ist das 5´-Monophosphat des nachfolgenden DNA-Strangs als Diphosphat aktiviert. Jetzt ist im Prinzip die Funktion der Ligase erfüllt, denn nun kann das 3´-OH des vorlaufenden Stranges quasi intramolekular an dem Phosphor nucleophil angreifen und das 5´-Mononucleosid substituieren (rote Pfeile). Die bakterielle Ligase nutzt als AMP-Quelle das NAD + (vgl. Praktikum Ligase und Transformation), während die Ligase aus Bakteriophagen ATP verwenden. Nur die hier gezeigte bakterielle Ligase kann vor dem Abschluss der Reaktion die DNA verlassen.
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