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Evolutive Methoden

Ribosome Display

Die ribosome display-Methode ist eine in vitro-Proteinbiosynthese, bei der alle Komponenten extrazellulär vorhanden sein müssen. Da normalerweise nach der Translation in der Zelle der mRNA-Ribosom-Protein-Komplex zerfällt und das Protein je nach Bestimmungsort exprimiert wird, können die DNA-Abschnitte den Proteinen, die sie codieren, nicht mehr zugeordnet werden.

Dieses Problem konnte 1997 von Hanes und Plückthun durch die Entwicklung eines Systems gelöst werden, das den mRNA-Ribosom-Proteinkomplex intakt hält und dennoch aktives Protein bildet. Anstelle eines Stop-Codons der mRNA folgt nach einer Spacersequenz eine Haarnadelschleife der RNA. Diese Schleife beendet die Translation genauso wie das Stop-Codon, stabilisiert aber im Gegensatz zu diesem den Komplex. Anschließend erfolgt die Untersuchung des gesamten Komplexes auf die Aktivität der Proteinkomponenten. Gebundene mRNA-Ribosom-Proteinkomplexe werden denaturiert und die mRNA isoliert. Die mRNA wird mittels der reversen Transkriptase in DNA überführt und kann dann durch die PCR vermehrt und sequenziert werden. Sie lässt sich aber auch erneut dem Ribosom-Selektionszyklus zuführen und erst nach einigen Runden sequenzieren. Die Ausbeute an intaktem Protein ist zwar mit 0,2 Prozent sehr gering, aber die ribosome display-Methode gehört in Kombination mit den Werkzeugen der gesteuerten Evolution zu den Methoden mit dem höchsten Potenzial an Diversität.

Abb.1
Ribosome Display
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