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DNA-Schäden

DNA-Ligase

Definition
DNA-Ligasen sind Enzyme, die die Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen einer freien 5'-Phosphat-Gruppe und einer freien 3'-Hydroxy-Gruppe zweier doppelsträngiger DNA-Fragmente katalysieren.
Abb.1
DNA-Ligase des Bakteriophagen T7

In der Zelle katalysieren diese Enzyme die Reparatur von Einzelstrangbrüchen und sind Bestandteile der Replikationsmaschinerie. In vitro verbinden die DNA-Ligasen sticky ends oder auch blunt ends von DNA-Fragmenten zur Herstellung von rekombinanter DNA.

Hinweis
Bakterien besitzen im Gegensatz zu eukaryontischen Zellen nur eine DNA-Ligase. Diese benötigt NAD (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid) als Cofaktor. In der eukaryontischen Zelle hingegen brauchen die mindestens zwei verschiedenen DNA-Ligasen ATP (Adenosin-triphosphat) als Cofaktor. Auch die phagencodierten DNA-Ligasen benötigen ATP zur Katalyse der Verknüpfungsreaktion.

Die Verknüpfung der DNA-Fragmente läuft unabhängig von der Natur des Cofaktors bei den verschiedenen DNA-Ligasen über ähnliche Zwischenschritte ab:

  1. Bildung eines Enzym-Nucleotid-Intermediats durch Transfer des AMP-Anteils von NAD bzw. ATP auf die ε-Amino-Gruppe einer Lysin-Seitenkette des Enzyms.
  2. Freisetzung von Nicotinamid-monophosphat (NMN+ ) bzw. -diphosphat. Die Adenyl-Gruppe (AMP) mit dem aktivierten Phosphat wird auf die 5'-Phosphat-Gruppe des offenen DNA-Stranges übertragen, die DNA wird dabei also adenyliert. In diesem Fall ist die Adenylat-Gruppe über ein Pyrophosphat an das 5'-Nucleotid gebunden und nicht, wie bei gewöhnlichen Adenylierungen, über eine Phosphodiester-Bindung.
  3. Bildung der Phosphodiester-Bindung über den Angriff der 3'-Hydroxy-Gruppe auf das aktivierte 5'-Phosphat mit der Freisetzung des AMP-Restes und des Enzyms.

Während die aus Escherichia coli isolierte Ligase auf beiden DNA-Strängen versetzt liegende, offene Phosphodiester-Bindungen spezifisch ligiert, führt die T4-Ligase (isoliert aus dem Bakteriophagen T4) noch zusätzlich die Verknüpfung von linearen, doppelsträngigen DNA-Fragmenten ohne überhängende Einzelstrangbereiche aus, die so genannte blunt end-Ligation. Damit wird z.B. die Zirkularisierung eines linearen, doppelsträngigen Moleküls möglich. Allerdings wird für solch eine Reaktion die 30-fache Menge an Ligase benötigt.

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