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Transformation und Transfektion

Calciumchlorid- oder Calciumphosphat-Methode

Calciumchlorid-Methode

Hinweis
Bei der Transformation wird vorwiegend die Calciumchlorid-Methode angewendet.
Abb.1
Calciumchlorid-Lösung

Das Prinzip dieser Technik beruht darauf, die Wirtszellen kompetent, d.h. aufnahmefähig für die DNA zu machen. Dazu behandelt man die Wirtszellen mit 0,1 molarer Calciumchlorid-Lösung. Calcium-Ionen im Überschuss verändern die Durchlässigkeit der Membran so, dass eine gesteigerte Aufnahmefähigkeit der Zellen für Fremd-DNA erlangt wird. Der Mechanismus dieses Phänomens ist allerdings noch nicht geklärt.

Die kompetenten Zellen können in großem Maße hergestellt und bei -70 °C für 3-4 Monate gelagert werden, ohne an Kompetenz zu verlieren. Nach Zugabe der Fremd-DNA müssen die Zellen einer Kälte/Wärmebehandlung unterzogen werden, um eine optimale Aufnahme der DNA zu erlangen.

Trägt die rekombinante DNA ein Resistenzgen als Marker, so werden die transformierten Zellen zunächst in einfaches Nährmedium (z.B. LB-Medium) überführt, um die Expression des Resistenzgens zu gewährleisten, bevor die Kultur in das Selektivmedium überführt werden kann.

Mit Hilfe dieser Technik können bis zu 105-109 Primärtransformanden pro µg DNA erzeugt werden.

Calciumphosphat-Methode

Hinweis
Die Calciumphosphat-Methode wird bei der Transfektion eingesetzt.

Die DNA wird bei dieser Technik mit Calciumchlorid und einer phosphathaltigen Pufferlösung gemischt. Dabei kommt es zu einer Ausbildung feiner DNA-Calciumphosphat-Kristalle, die sich, wenn sie mit den Zellen in Kontakt kommen, auf der Zelloberfläche niederschlagen. Über Endocytose wird dann die DNA in die Zelle aufgenommen. Auch dieser Mechanismus ist weitgehend ungeklärt.

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