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Werkzeuge der Gentechnik

Restriktionsendonucleasen

Restriktionsendonucleasen bzw. Restriktionsenzyme spalten DNA1)-Moleküle sequenzspezifisch. Diese Eigenschaft macht die Restriktionsendonucleasen zu einem der wichtigsten Werkzeuge der Gentechnik.

Restriktionsendonucleasen stammen aus Bakterien und können artfremde DNA (z.B. virale DNA) erkennen und spalten (Restriktion oder Verdau der Fremd-DNA). Die DNA der Zelle wird nicht angegriffen, da die Restriktionsendonuclease-spezifischen Sequenzen der zelleigenen DNA durch Methylierung geschützt sind.

Gemeinsam mit den DNA-Methylasen bilden die Restriktionsendonucleasen das Restriktions-Modifikations-System der Bakterienzellen. Die verschiedenen Bakterienstämme besitzen jeweils eigene Modifikationssysteme und Restriktionsendonucleasen.

Restriktionsendonucleasen erkennen spezifisch Sequenzen von 4-6 Nucleotiden Umfang und spalten dort die Phosphodiester-Brücken. Durch Hydrolyse der Phosphorsäurediester-Bindung in beiden Strängen, die symmetrisch oder versetzt ablaufen kann, kommt es zur Ausbildung von glatten (blunt ends) oder 3'- bzw. 5'-überhängenden Enden (sticky ends).

Zur Herstellung von Restriktionsfragmenten mit exakten Fragmentlängen muss ein kompletter Verdau des DNA-Moleküls durch die Restriktionsenzyme erfolgen. Dabei beträgt die Inkubationszeit für den Spaltungsansatz je nach Menge an DNA mindestens 1-12 Stunden. Bei verschiedenen Klonierungsstrategien, wie z.B. dem Anlegen von Genbanken, wird häufig der so genannte Partialverdau angewendet. Es handelt sich hierbei um einen unvollständigen Restriktionsverdau eines DNA-Moleküls, das für ein bestimmtes Restriktionsenzym mehrere Schnittsequenzen besitzt. Durch eine deutlich verkürzte Inkubationszeit sowie eine verringerte Enzymkonzentration werden nur manche der Erkennungssequenzen gespalten. Dabei entstehen verschieden lange Restriktionsfragmente mit jeweils identischen Enden.

Die Basen in den Erkennungssequenzen der meisten gentechnisch verwendeten Restriktionsendonucleasen zeigen eine kreuzweise spiegelbildliche Anordnung. Diese Formation wird als Palindrom bezeichnet.

Die Bezeichnung der Restriktionsendonucleasen besteht jeweils aus der dreibuchstabigen Abkürzung der Bakterienspezies und dem Stamm, aus dem das Enzym isoliert wird (z.B. EcoRI für das erste aus Escherichia coli Stamm R isolierte Typ II-Restriktionsenzym).

Tab.1
Häufig benutze Restriktionsendonucleasen mit ihren palindromen Erkennungssequenzen und den Schnittstellen (durch * markiert)
RestriktionsenzymUrsprungsorganismusErkennungssequenzEinzelstrang-Ende
EcoRI Escherichia coli G*AATTC sticky ends
  CTTAA*G 
BamHI Bacillus amyloliquefaciens G*GATCC sticky ends
   CCTAG*G 
PvuI Proteus vulgaris CG*ATCG sticky ends
  GCTA*GC 
PvuII Proteus vulgaris CAG*CTG blunt ends
   GTC*GAC 
Abb.1
Verschiedene Restriktionsenzyme
Hinweis
Die Menge an Restriktionsenzym wird in Units (Einheiten) angegeben: Eine Unit ist die Enzym-Menge, die in einer Stunde bei optimalen Reaktionsbedingungen 1 µg DNA spaltet.

Restriktionsenzyme zählen zu den Endonucleasen. Als Nucleasen werden Enzyme bezeichnet, die Nucleinsäuren durch Spaltung der Phosphodiester-Bindungen abbauen können. Endonucleasen schneiden innerhalb der Nucleinsäure-Stränge. Exonucleasen bauen Nucleinsäuren hingegen von einem Ende her ab.

Je nach Art der Erkennungs-und Schnittsequenzen unterscheidet man drei verschiedene Typen von Restriktionsendonucleasen: Typ I, II und III. Den Nucleasen des Typs II kommt die wichtigste Bedeutung in der Gentechnologie zu.

1)DNA: Desoxyribonucleinsäure
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