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Werkzeuge der Gentechnik

DNA- und RNA-abhängige DNA-Polymerasen

Abb.1
3D-Modell der DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase)

Klick auf das Bild öffnet das animierte 3D-Modell; PDB-Code: 1TAQ.

DNA-Polymerasen dienen der Synthese und Vervielfältigung von DNA-Sequenzen. Bei der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen hitzestabile DNA-Polymerasen die zyklische Amplifikation von DNA-Fragmenten, ohne dass in jedem Zyklus neu Enzym hinzugegeben werden muss. Bei der DNA-Sequenzierung nach Frederick Sanger (Kettenabbruch-Verfahren) katalysieren DNA-Polymerasen die Synthese von DNA-Fragmenten. DNA-Polymerasen werden auch bei in vitro-Markierung der DNA eingesetzt, z.B. bei der nick translation zum Einbau modifizierter Nucleotide. Daneben katalysieren diese Enzyme das Auffüllen von überhängenden Enden bei Restriktionsfragmenten.

Hinweis
Für die Synthese und Amplifikation von DNA ist es besonders wichtig, dass die eingesetzte DNA-Polymerasen keine 5'-3'-Exonuclease-Aktivität mehr besitzt, da so der neu synthetisierte Strang vom 5'-Ende her wieder abgebaut werden würde.

Das Klenow-Fragment erfüllt diese Anforderung. Es handelt sich bei diesem Molekül um die DNA-Polymerase I, deren 5'-3'-Exonuclease-Aktivität durch die Abspaltung eines kleinen aminoterminalen Bereiches entfernt wurde. Mittlerweile ist eine Vielzahl von DNA-Polymerasen erhältlich, deren 5'-3'-Exonuclease-Aktivität stark herabgesetzt ist oder entfernt wurde.

Die reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, die von Retroviren codiert wird. Dieses Enzym ist in der Lage, die DNA-Kopie einer RNA-Matrize zu erstellen.

Die Entdeckung der reversen Transkriptase widerlegte die bis dahin herrschende Meinung, dass die genetische Information in der Natur immer nur von DNA zu RNA fließt.

Mit der Hilfe der reversen Transkriptase können aus zellulärer mRNA cDNA-Moleküle synthetisiert werden, die in cDNA-Banken zusammengefasst werden. cDNA-Moleküle können unter Entstehung von rekombinanter DNA in Vektoren einkloniert und so verschiedenen Testsystemen unterzogen werden. Daneben werden cDNA-Moleküle als Gensonden beim Blotting eingesetzt, um mRNA-Moleküle spezifisch nachzuweisen.

Nachfolgend werden kurz einige wichtige DNA-Polymerasen vorgestellt:

Tab.1
Wichtige DNA-Polymerasen
DNA-Polymerase I Polymerase aus Escherichia coli mit 3'-5'- und 5'-3'-Exonuclease-Aktivität. Als Cofaktor werden Mg2+-Ionen benötigt. Die drei enzymatischen Aktivitäten sind in drei verschiedenen Domänen des Enzyms lokalisiert und erlauben daher die Isolierung des Klenow-Fragments ohne 5'-3'-Exonuklease-Aktivität.
T4-DNA-Polymerase Sie wird von dem Coli-Phagen T4 codiert. Dieses Enzym verfügt über die 3'-5'-Exonuclease-Aktivität, ihm fehlt aber die 5'-3' Exonuclease-Aktivität. Dabei zeigt die T4-DNA-Polymerase die gleichen Eigenschaften wie das Klenow-Fragment, katalysiert die Reaktionen jedoch wesentlich schneller.
T7-DNA-Polymerase Sie wird von dem Coli-Phagen T7 codiert. Dieses Enzym weist die gleichen Eigenschaften wie das Klenow-Fragment und die T4-DNA-Polymerase auf, verfügt jedoch über eine deutlich höhere Prozessivität. Das Enzym ist damit in der Lage, sehr lange DNA-Bereiche zu synthetisieren, ohne dabei von der DNA-Matrize abzudissoziieren.
Taq-Polymerase Sie wird aus dem thermophilen Prokaryonten (Thermus aquaticus) isoliert und hat ein Temperaturoptimum von ca. 80 °C Die Taq-Polymerase verfügt über keine 3'-5'-Exonuclease-Aktivität.
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