Werkzeuge der Gentechnik
Phosphatasen
- Definition
- Phosphatasen hydrolysieren Phosphomonoester-Bindungen, also beispielsweise die 5'-Phosphat-Gruppen von Nucleinsäuren, Nucleosid-monophosphaten oder Zuckerphosphaten.
Die verschiedenen Phosphatasen haben sehr unterschiedliche pH-Optima, es gibt z.B. saure oder alkalische Phosphatasen. In der Gentechnologie benötigt man Phosphatasen, um endständige Phosphat-Guppen von DNA-Fragmenten zu entfernen. Dies dient als Vorbehandlung für eine radioaktive Markierung des 5'-Endes eines natürlichen DNA- oder RNA-Fragments.
Phosphatasen und Ligase-Reaktion
Eine wichtige Bedeutung liegt auch darin, die bei der Ligation von rekombinanter DNA mit Restriktionsenzymen behandelten Plasmid-Vektoren an der Monoligation (Vektorschluss ohne Insert) zu hindern. Das Produkt der Ligation mit Phosphatase-behandeltem Vektor ist ein ringförmiges Plasmid mit zwei weit voneinander entfernten nicks. Diese nicks sind Substrat für die E.coli-Ligase und werden von der Zelle repariert (zur Vergrößerung bitte das Bild anklicken).
- Abb.2
Die Phosphatase-Reaktion muss bei der Durchführung einer Ligation in einer so genannten Vektorkontrolle kontrolliert werden. Hierbei wird der Phosphatase-behandelte Vektor ohne Insert-Anteil in die Ligation eingesetzt. Nur monoligierte Vektoren zeigen ein Kolonienbild auf den Selektionsplatten; die Anzahl der Kolonien lässt Rückschlüsse auf die Aktivität der verwendeten Phosphatase zu.
- Hinweis
- Wichtig ist bei diesen Enzymen, dass nach einer bestimmten Reaktionsdauer eine Inaktivierung erfolgt, z.B. durch Hitzeeinwirkung, um die Dephosphorylierung ausschließlich auf die Zielregion zu beschränken.
