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Werkzeuge der Gentechnik

DNA-Ligasen

Definition
DNA-Ligasen sind Enzyme, die die Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen einer freien 5'-Phosphat-Gruppe und einer freien 3'-Hydroxy-Gruppe zweier doppelsträngiger DNA-Fragmente katalysieren.
In der Zelle katalysieren diese Enzyme die Reparatur von Einzelstrangbrüchen. In vitro verbinden die DNA-Ligasen offene Enden (sticky ends oder auch blunt ends) von DNA-Fragmenten zur Herstellung von rekombinanter DNA.
Abb.1
DNA-Ligase des Bakteriophagen T7

Bakterien besitzen im Gegensatz zu eukaryontischen Zellen nur eine DNA-Ligase. Diese benötigt NAD als Cofaktor, während die beiden verschiedenen DNA-Ligasen eukaryontischer Zelle ATP als Cofaktor verwenden. Auch die phagencodierten DNA-Ligasen brauchen ATP zur Katalyse der Verknüpfungsreaktion. Die Verknüpfung der DNA-Fragmente läuft, unabhängig von der Natur des Cofaktors, bei den verschiedenen DNA-Ligasen über ähnliche Zwischenschritte ab:

  1. Bildung eines Enzym-Nucleotid-Intermediats durch Transfer des AMP-Anteils von NAD bzw. ATP auf die ε-Amino-Gruppe einer Lysin-Seitenkette des Enzyms.
  2. Freisetzung von Nicotinamid-monophosphat (NMN+ ) bzw. -diphosphat. Die Adenyl-Gruppe (AMP) mit dem aktivierten Phosphat wird auf die 5'-Phosphat-Gruppe des offenen DNA-Stranges übertragen, die DNA wird dabei also adenyliert. In diesem Fall ist die Adenylat-Gruppe über ein Pyrophosphat an das 5'-Nucleotid gebunden und nicht, wie bei gewöhnlichen Adenylierungen, über eine Phosphodiester-Bindung.
  3. Bildung der Phosphodiester-Bindung über den Angriff der 3'-Hydroxy-Gruppe auf das aktivierte 5'-Phosphat mit der Freisetzung des AMP-Restes und des Enzyms.
Abb.2
Abb.3
Abb.4

Bei den Klonierungsexperimenten im Labor liegt die optimale Reaktionstemperatur für die DNA-Ligase also bei 16 °C. Häufig wird diese Reaktion auch über Nacht im Kühlraum durchgeführt. Die Ausbeute unterscheidet sich zumeist nicht gravierend.

Dieser Befund widerspricht zunächst dem Temperaturoptimum von 37 °C, wie ihn fast alle bakteriellen Enzyme aufweisen. Es liegt jedoch eine zweistufige Reaktion vor, bei der die Atmungsaktivität der DNA-Fragment-Enden der geschwindigkeitsbestimmende Faktor ist. Bei Temperaturen über 25 °C ist sie so stark, dass das Enzym nicht mehr in der Lage ist, effektiv an beide Fragmente zu binden, um die Verknüpfungsreaktion zu katalysieren. Bei Temperaturen unter 10 °C ist die Atmungstätigkeit der Fragmente zwar am geringsten, aber die Ligase-Aktivität ist gleichfalls stark herabgesetzt. Längere Inkuabtionszeiten können das ausgleichen, wie im zugehörigen Versuch gezeigt wird.

Während die aus Escherichia coli isolierte Ligase auf beiden DNA-Strängen versetzt liegende, offene Phosphodiester-Bindungen spezifisch ligiert, führt die T4-Ligase (isoliert aus dem Bakteriophagen T4) noch zusätzlich die Verknüpfung von linearen, doppelsträngigen DNA-Fragmenten ohne überhängende Einzelstrangbereiche aus, die so genannte blunt end-Ligation. Damit wird z.B. die Zirkularisierung eines linearen, doppelsträngigen Moleküls möglich. Allerdings wird für solch eine Reaktion die 30-fache Menge an Ligase benötigt.

Hinweis
Nur die DNA-Ligase aus Phagen (T4 oder T7) ermöglicht eine uneingeschränkte Kombination von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Herkunft zur Herstellung von rekombinanter DNA.
Tab.1
Substrate der DNA-Ligasen
SubstratErläuterung
Abb.5
Die beiden Quellen für den AMP-Rest im Vergleich. Das E. coli-Enzym ist ein reines Reparaturenzym. Die Phagen-Ligase hilft bei der Verknüpfung fremder DNA-Stränge.
Abb.6
Dieser so genannte nick kann auch von der E. coli-Ligase erkannt werden.
Abb.7
Hier kann die E. coli-Ligase bereits nicht mehr arbeiten, weil diese Struktur bei ihrem Temperaturoptimum instabil ist.
Abb.8
Eine biotechnisch gewollte Situation, die von der Phagen-Ligase erkannt wird. Das rot eingefärbte 5'-OH gehört bei Klonierungsexperimenten zum Vektor und verhindert die Selbstligation des Vektors. Der verbleibende nick wird in der Zelle repariert.
Abb.9
Blunt end Ligation! Schwer, aber für die Phagen-Ligase immer noch machbar.
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