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Gentechnische Methoden

Mutagenese mit Hilfe der PCR: eine Einführung

Anfang der achtziger Jahre gelang es erstmals, DNA-Sequenzen gezielt zu verändern (der Chemie-Nobelpreis 1993 ging zu gleichen Teilen an Kary Mullis für die Entdeckung der PCR und an Michael Smith für die erste gerichtete Mutagenese). Anfänglich war die Ausbeute an Mutanten nur gering. Obwohl im Laufe der Zeit immer bessere Verfahren mit höherer Ausbeute entwickelt wurden, brachte erst die Kombination mit der PCR eine verlässliche Methode für die gezielte Mutagenese.

Abb.1
Schematische Darstellung der gezielten Deletion eines Plasmid-DNA-Abschnittes mit inverser PCR.

Die inverse PCR dient der Amplifikation von zirkulärer bzw. Plasmid-DNA. Durch Modifikation der Primer lassen sich die Mutationen während der Amplifikation gezielt und einfach platzieren.

Nach der Amplifikation ist der direkte Ringschluss der neu synthetisierten Plasmid-DNA nur dann möglich, wenn die modifizierten Primer zuvor am 5´-Ende phosphoryliert wurden. Dies geschieht mit Hilfe einer Polynucleotidkinase, die die Phosphat-Gruppen von ATP-Molekülen auf die 5´-OH-Gruppen von einzel- oder doppelsträngiger DNA überträgt.

Um die Wildtyp-DNA (das Ausgangsmaterial) nach der Amplifikation aus dem Reaktionsansatz zu entfernen, wird diese einem Verdau mit einer Endonuclease (z.B. DpnI) unterzogen, die ausschließlich methylierte oder hemimethylierte DNA spaltet. Da die PCR-Produkte nicht methyliert werden, werden diese nicht abgebaut und so selektioniert.

Einführung von Insertionen

Durch die Modifikation der entsprechend gewählten Primer können Insertionen gezielt und einfach platziert werden. Dabei ist zu beachten, dass beide Primer ausschließlich am 5´-Ende modifiziert werden, da eine Modifikation des 3´-Endes die zur Strangsynthese durch die DNA-Polymerase benötigte exakte räumliche Positionierung der 3´-OH-Gruppe zum Phosphat-Rest des einzubauenden Nucleotides unterbindet.

Bei der Modifikation der Primer kann es sich z.B um das Anfügen von Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen handeln, die dann eine gezielte Einklonierung von Genen oder anderen Sequenzbereichen erlauben. Daneben können aber auch nur vereinzelte oder sehr wenige Nucleotide eingebracht werden, um z.B die Auswirkungen einer Verschiebung des Leserasters eines Proteins an einer bestimmten Position zu untersuchen.

Einführung von Deletionen

Bei der Einführung einer Deletion werden die Positionen der Primer so bestimmt, dass der zu deletierende Sequenzbereich durch die Primer flankiert wird.

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