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Gentechnische Methoden

Ablauf der Gelelektrophorese

Für die Auftrennung von DNA-Fragmenten mit 500-20.000 bp Größe werden Agarose-Gele mit Agarose-Konzentrationen von 0,7-2,0 % verwendet. Mit steigender Agarose-Konzentrationen nimmt der Vernetzungsgrad der Agarose zu, so dass sich kleinere Fragmente besser auftrennen lassen.

Die Agarose wird im jeweiligen Laufpuffer aufgekocht, abgekühlt und bis zu einer Dicke von ca. 3-6 mm in den Gelschlitten gegossen. Durch Einstecken eines PVC-Kammes in die noch flüssige Agarose ergeben sich nach dem Abkühlen eine Reihe von Taschen im Gel, die später die Proben aufnehmen werden. Das maximale Volumen einer so genannten analytischen Tasche liegt bei 20 µl. Die DNA-Proben werden vor dem Auftragen mit 10 % Glycerol-haltigem Auftragspuffer versetzt, der die DNA-Lösung beschwert, so dass diese nach dem Einfüllen in die Auftragstaschen sinkt und nicht in den Laufpuffer diffundiert.

Abb.1
Entfernung des PVC-Kammes

In der Regel wird eine Spannung von 100 V in der mit Laufpuffer gefüllten Gelkammer angelegt. Die Auftragspuffer enthalten Farbstoffe (üblicherweise Bromphenolblau und Xylencyanol), die im elektrischen Feld mit der DNA in Richtung Anode wandern und so einen Anhaltspunkt für die Wanderung der DNA geben. Bromphenolblau wandert im Agarose-Gel beispielsweise parallel zur DNA mit einer Größe von ca. 450 bp.

Nach dem Gellauf werden die DNA-Banden durch Eintauchen in stark verdünnte Ethidiumbromid-Lösung angefärbt. Das Ethidiumbromid interkaliert dabei in die DNA. Bei Bestrahlung mit UV-Licht fluoresziert der Ethidiumbromid-DNA-Komplex bei 254 nm. Die Gele können fotografiert werden und stehen entweder als Papierkopie oder in digitaler Form zur Verfügung.

Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten zwischen 40-500 bp werden 7,5 %ige Polyacrylamid-Gele bei prinzipell ähnlicher Durchführung verwendet. Hierbei wird die Elektrophorese in vertikalen Gelapparaturen durchgeführt (Polyacrylamid-Gelelektrophorese).

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