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Gentechnische Methoden

Beispiel eines Expressionsvektors auf der Basis des lac-Operons

Das bekannteste induzierbare System besteht aus den regulatorischen Elementen des lac-Operons.

Abb.1
Essenzielle Elemente eines Expressionsvektors

Neben dem lac-Promotor, dem lac-Operator und der Ribosomen-Bindungsstelle (SDS = Shine-Dalgarno-Sequenz) verfügt der Vektor über das Gen für den lac-Repressor, der an die Operator-Sequenz des Promotors bindet und zunächst die Genexpression reprimiert. Die Induktion der Expression erfolgt durch spezifische Substanzen (z.B. IPTG), die den Repressor binden können. Dadurch ändert dieser seine Konformation und wird inaktiviert. Der Promotor ist nun für die RNA-Polymerase zugängig und es kommt zur Initiation der Transkription. Weitere wichtige Elemente sind:

  • die multiple Klonierungsstelle (Multilinker), also eine Folge von singulären Restriktionschnittstellen, in die ein Gen kloniert und gezielt unter die Kontrolle des Promotor-Operator-Systems gestellt werden kann.
  • der Terminator. Dieses Sequenzelement zeigt auf DNA-Ebene inverse repetitive Sequenzen, die auf RNA-Ebene Haarnadelschleifen ausbilden können und so zu einer Instabilisierung des RNA/DNA-Hybrides an der RNA-Bindestelle im RNA-Polymerase-Komplex führen. Dadurch kommt es zur gezielten Termination der Transkription.
  • der Replikationsstart (ori = origin of replication), der die autonome Replikation des Vektors gewährleistet,
  • und einen Marker (Antibiotiaresistenz), der nach der Transformation die Selektion der vektortragenden Bakterienzellen ermöglicht.

Anstelle des lac-Promotors wird häufig auch der tac-Promotor verwendet, ein Hybrid aus dem lac- und dem trp-Promotor. Dieser Promotor verbindet die hohe Transkriptionseffizienz des trp-Promotors mit der leichten Induzierbarkeit des lac-Promotors.

Viele Expressionssysteme tragen für die Isolierung des Proteins distal der Ribosomenbindungsstelle und des Promotors noch zusätzlich das kurze offene Leseraster des His-Tags, an den sich direkt der Multilinker anschließt. Wird hier ein Gen im gleichen Leseraster wie der His-Tag integriert, entsteht ein Fusionsprotein, das sich über die Histidin-Sequenz affinitätschromatographisch reinigen lässt.

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