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Gentechnische Methoden

Die Isolierung von Plasmid-DNA mit der Minilysat-Methode

Die Minilysat-Methode ist eines der am häufigsten verwendeten Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli. Zunächst werden durch die Resuspension der Bakterienpellets in EDTA1)-haltigem Puffer zweiwertige Kationen, die für die Stabilität der Zellwand essenziell sind, komplexiert. Dies führt zu einer starken Destabilisierung der Zellwand, bevor dann SDS2) und NaOH zur Bakteriensuspension gegeben werden. Das Detergenz SDS solubilisiert die Phospholipide und Proteine der Cytoplasmamembran, so dass die Zellen nun vollständig lysieren; NaOH denaturiert Proteine, Chromosom und Plasmid-DNA. Das Prinzip der Isolierung von Plasmid-DNA beruht auf der schnelleren Renaturierung der sehr kompakten Plasmid-DNA im nun folgenden Neutralisierungsschritt.

Abb.1
Prinzip der Plasmid-DNA-Isolierung

Während der Lyse der Bakterienzellen denaturieren Chromosom und Plasmid-DNA in Gegenwart von NaOH, d.h. die einzelnen, homologen DNA-Stränge werden getrennt (im Bild blau und rot dargestellt). (2) Nach einer Zugabe von Natriumacetat wird nun nur die ringförmige, kovalent geschlossene Plasmid-DNA schnell renaturiert, während die denaturierte chromosomale DNA als unlösliches Aggregat ausfällt und mit dem bakteriellen Debris durch Zentrifugation von der gelösten Plasmid-DNA abgetrennt werden kann. Die Plasmid-DNA wird im letzten Schritt durch eine Fällung mit Isopropanol oder Ethanol aus dem Überstand gewonnen.

1)EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
2)SDS: sodium dodecyl sulfate
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