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Gentechnische Methoden

Die Lyse der Bakterienzellen

Abb.1
Bakterielle Zellkultur
Institut für Technische Chemie, Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover

Die Isolierung der DNA beginnt mit der Lyse der Bakterienzellen, die aus einer Kultur mit möglichst hoher Zelldichte durch Zentrifugieren gewonnen werden können und dann in einem entsprechenden Zellaufschlusspuffer resuspendiert werden. Während die kleinen ringförmigen Plasmide relativ schnell aus bakteriellen Zellen freigesetzt werden, zerbricht die chromosomale DNA leicht, wenn bei der Isolierung Scherkräfte auftreten.

Ein schonender Zellaufschluss wird durch die Verwendung von Enzymen erreicht, während mechanische Verfahren wie die Ultraschallbehandlung, das Aufbrechen von Zellen in der French Press oder der Glasperlenmühle für die DNA-Isolierung grundsätzlich nicht zu empfehlen sind, da große DNA-Moleküle bei diesen Verfahren fragmentiert werden.

A. Der enzymatische Aufschluss

Für die Isolierung von genomischer DNA werden bakterielle Zellen bevorzugt mit einer Kombination von Enzymen wie beispielsweise Lysozym und Proteinase K aufgeschlossen. Lysozym ist ein im Hühnereiweiß oder der Tränenflüssigkeit vorkommendes Enzym, das die glycosidischen Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure (NAM) und N-Acetylglucosamin (NAG) im Murein-Sacculus der Bakterienzellwand hydrolysiert. Proteinase K ist eine Serin-Protease, die gezielt Peptidbindungen spaltet, bei denen eine der beiden beteiligten Aminosäuren aromatischen, aliphatischen oder hydrophoben Charakter aufweist. Dieses Enzym arbeitet optimal bei 55-60 °C und in Gegenwart von 0,5 % SDS, so dass die Cytoplasmamembran der Bakterienzellen bereits bei der Inkubation in Proteinase K-Puffer aufbricht.

Abb.2
Lysozym spaltet β-glycosidische Bindungen
Abb.3
Proteinase K aus Tritirachium album

B. Der Aufschluss durch Detergenzien

Bei der Gewinnung der Plasmid-DNA wird vorrangig mit Detergenzien gearbeitet. Für den Zellaufschluss mit Detergenzien gibt es verschiedene Methoden, die je nach Art und Verwendung der zu isolierenden Plasmid-DNA eingesetzt werden:

  • Die Minilysat-Methode oder alkalische Lyse ist die gebräuchlichste Methode zur Isolierung von Plasmid-DNA, die auch für große und low copy-Plasmide sehr gut geeignet ist. Hier werden die Zellen durch eine Kombination von Natriumdodecylsulfat (SDS1)) und NaOH aufgeschlossen.
  • Bei der Kochlyse werden die bakteriellen Zellwände durch Lysozym zerstört und die lysierten Bakterien für kurze Zeit aufgekocht. Aus dem Lysat werden die bakteriellen Zellreste (Debris) durch Zentrifugation entfernt und die Plasmid-DNA anschließend präzipitiert.
  • Das nichtionische Detergenz Triton X-100 kann in Anwesenheit von hohen Konzentrationen Lithiumchlorid ebenfalls zum Aufschluss der Bakterienzellen eingesetzt werden. Im Anschluss an eine Lysozym-Behandlung führt diese so genannte Lithium-Methode zur Auflösung der bakteriellen Cytoplasmamembran. Nach der vollständigen Denaturierung der Proteine durch Phenol/Isoamylalkohol kommt es zur Freisetzung der Plasmid-DNA. Diese Methode eignet sich allerdings nicht für die Isolierung größerer Plasmide.
1)SDS: sodium dodecyl sulfate
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