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Gentechnische Methoden

Die Hybridisierung

Hybridisierungsverfahren basieren auf der Detektion von Nucleinsäure-Targetmolekülen durch sequenzspezifische Anlagerung komplementärer, einzelsträngiger, markierter Nucleinsäure-Sonden.

Abb.1
Konstruktion von Oligonucleotid-Sonden zur Identifizierung von Proteinsequenzen

Ausgehend von der Proteinsequenz wird ein Gemisch von Oligonucleotiden synthetisiert, das den degenerierten Code für jede Aminosäure berücksichtigt. Alternativ kann auf der Basis des bekannten GC-Gehalts oder der Codon-Häufigkeit (codon usage) einer Spezies ein so genanntes guessmer (nach engl. to guess, "vermuten") entwickelt werden, das möglicherweise nicht an allen Stellen zu 100 % homolog ist und im hier gezeichten Beispiel zwei Fehlpaarungen (mismatches) aufweist. Durch die Hybridisierung lässt sich das zur Proteinsequenz homologe DNA-Fragment auch mit nicht vollständig passenden Oligonucleotiden identifizieren und die DNA-Sequenz durch eine nachfolgende Sequenzierung eindeutig bestimmten.

Durchführung einer Hybridisierung

  • Vor dem Transfer (Blotting) wird die DNA im Agarose-Gel durch eine Behandlung mit HCl und NaOH depuriniert und denaturiert, da nur einzelsträngige DNA für die Hybridisierungsreaktion verwendet werden kann und diese Behandlung die Effizienz des Transfers erhöht.
  • Gleich nach dem Transfer wird die DNA durch UV-Bestrahlung ( cross-linking ) oder Backen der Membran fest an das Trägermaterial gebunden.
  • Unbesetzte Bindungsstellen der Folie müssen nach dem cross-linking mit Hilfe spezieller Reagenzien in einer Vor- oder Prähybridisierung blockiert werden, um den Hintergrund zu reduzieren und falsch-positive Signale zu verhindern. Die Prähybridisierungslösung wird später durch die eigentliche Hybridisierungslösung ersetzt, die sich von der Hybridisierungslösung in ihrer Zusammensetzung bis auf die markierte Sonde nicht unterscheidet. Während der Hybridisierung binden die markierten Gensonden in der Hybridisierungslösung an die komplementäre Nucleinsäure auf der Folie, bevor nichtgebundene Sondenmoleküle durch mehrere Waschvorgänge entfernt werden. Der Blot kann nun durch Autoradiographie, anhand spezieller Detektionssysteme (bei fluoreszenzmarkierten Gensonden) oder durch enzymgekoppelte Farbreaktionen (bei Digoxigenin- oder Biotinmarkierung) analysiert werden.
  • Als Sonden können Oligonucleotide, DNA-Fragmente, PCR1)-Produkte oder in vitro-RNA-Transkripte eingesetzt werden. Bei einer Hybridisierung können DNA:DNA-, DNA:RNA- oder RNA:RNA-Hybride entstehen.
Abb.2
Pipettierschritt
Hinweis
Achtung! Eine oft unterschätzte Fehlerquelle bei Hybridisierungen ist die substöchiometrische Anwesenheit von stark homologen DNA-Anteilen, wie z.B. von Vektoranteilen, die das Ergebnis einer Hybridisierung verfälschen können. Dieses kann aber auch ausgenutzt werden, um eine universelle Probe für die Anwesenheit verschiedene Plasmide (die auf dem gleichen Vektor basieren) zu haben.
1)PCR: Polymderase-Kettenreaktion
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