Arbeitsprotokoll
- 4,1 CsCl wird in Corex-Röhrchen eingewogen und 4 DNA-Lösung in TE-Puffer zugegeben.
- Nach Zugabe von 300 µl Ethidiumbromid-Lösung (5 /) wird der Ansatz vorsichtig gut durchmischt.
- Die Corex-Röhrchen werden für 30 bei 20.000 rpm zentrifugiert. Bei diesem Schritt setzen sich Verunreinigungen
(z.B. durch Proteine) als Pellet ab oder bilden einen flockigen Film auf der Oberfläche.
- Der Überstand wird möglichst frei von Verunreinigungen mit einer Pasteurpipette abgenommen und in
Quickseal-Röhrchen gefüllt. Jeweils zwei der Quickseal-Röhrchen werden, ggf. durch Zugabe von
CsCl-Lösung (4,1 CsCL in TE-Puffer), auf der Feinwaage genau austariert, die Öffnungen werden
verschweißt und die Röhrchen in den Ultrazentrifugenrotor gesetzt.
- Die Zentrifugation erfolgt über Nacht bei 4 und 50.000 rpm (Rotor Vti65) im Vakuum.
- Am nächsten Morgen kann die untere Bande, die die supercoil-Plasmid-DNA
enthält, unter UV-Licht mit einer Kanüle abgezogen werden.
- Die Plasmidfraktion wird dreimal mit CsCl-gesättigtem Isopropanol extrahiert, um das
Ethidiumbromid zu entfernen, danach in sterile Dialyseschläuche gefüllt und bei 4 für 2 x 2 Stunden gegen jeweils 2 TE-Puffer dialysiert.
