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Gentechnische Methoden

Das Temperaturprofil einer typischen PCR

Bei einer PCR werden drei Reaktionsschritte in einem zyklischen Prozess wiederholt. Jeder Zyklus dauert nur wenige Minuten und verdoppelt die Anzahl an Produkten - daher wächst in kurzer Zeit die Anzahl der PCR-Produkte exponentiell an.

  1. Denaturierung: Aufschmelzen der DNA, des so genannten Templates.
  2. Primer-Annealing: Anlagerung der Primer an das Template.
  3. Primer-Extension: Verlängerung der Primer durch die DNA-Polymerase.

Im Labor wird vor dem eigentlichen PCR-Zyklus häufig eine längere einmalige Denaturierung durchgeführt, da für das Aufbrechen der Template-DNA beim ersten Mal mehr Energie als bei den weiteren Denaturierungsschritten erforderlich ist. Das gilt besonders für lange DNA-Moleküle wie z.B. genomische DNA.

In der Praxis zeigte sich auch, dass eine verlängerte abschließende Synthesephase (im gezeigten Beispiel für 4 min bei 72 °C) zu einer höheren Ausbeute an PCR-Produkten führt. In dieser Zeit werden eventuell noch unfertige DNA-Fragmente zum vollständigen PCR-Produkt aufgefüllt. Nach Ende des letzten Schrittes werden die Proben automatisch auf 4 °C abgekühlt und können dann entnommen werden.

Jede PCR hat ihr eigenes charakteristisches Temperaturprofil, das vor allem durch die Schmelztemperatur der Template-DNA und die optimale Annealing-Temperatur der Primer bestimmt wird. Ein Beispiel zeigt die folgende Abbildung (Abb. 1) :

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Abb.1
Der zyklische Ablauf einer PCR
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