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Gentechnische Methoden

Ablauf einer PCR

Die Polymerase-Kettenreaktion ist ein zyklischer Prozess, bei dem drei Schritte immer wieder ablaufen, bis die Reaktion zum Erliegen kommt.

  1. Das Schmelzen der doppelsträngigen DNA (Denaturierung)Die Kopiervorlage (Template) für die PCR ist in den meisten Fällen eine doppelsträngige DNA1), es kann aber auch eine RNA2) eingesetzt werden. Bei hohen Temperaturen schmilzt der DNA-Doppelstrang in zwei einzelne, komplementäre3) DNA-Stränge. Im ersten Schritt einer PCR, der üblicherweise bei ca. 92 °C für 30 Sekunden stattfindet, werden die DNA-Doppelstränge voneinander getrennt.
  2. Das Binden kurzer Oligonucleotide an die einzelsträngige DNA (Primer-Annealing)Ein Primer ist ein kurzes, einzelsträngiges DNA-Fragment. Dieser Primer findet auf der ebenfalls einzelsträngigen DNA seinen "Gegenpart", also eine zu diesem Primer komplementäre Sequenz, und bindet an diese. Die Temperatur, bei der dieser Schritt durchgeführt wird, hängt von der Schmelztemperatur der verwendeten Primer ab und wird für jedes Experiment genau berechnet. Ist die Temperatur zu hoch gewählt, kann der Primer nicht mehr binden, ist sie zu niedrig, bindet der Primer auch an anderen Stellen an die DNA. Übliche Bedingungen sind beispielsweise 50-60 °C für 30 Sekunden.
  3. Die Verlängerung des Primers durch das Enzym DNA-Polymerase (Primer-Extension)Die DNA-Polymerase ist ein Enzym, das einzelsträngige DNA wieder zum Doppelstrang ergänzt. Dazu benötigt sie allerdings ein kurzes Stück Doppelstrang, wie es im vorherigen Schritt durch die Bindung des Primers an die DNA entstanden ist. Die DNA-Polymerase erkennt das freie 3'-Ende des Primers und fügt nun Nucleotid für Nucleotid an, bis der DNA-Doppelstrang wieder vollständig ist. Dieser Schritt erfolgt beim Temperaturoptimum der Polymerase, d.h. im Fall einer hitzestabilen Polymerase bei einer Temperatur von ca. 72 °C für 60 Sekunden.

Das Ergebnis dieser drei Schritte einer PCR sind zwei DNA-Moleküle, die beide wieder zum Doppelstrang ergänzt worden sind. Nach Beendigung dieses letzten Schrittes beginnt der Zyklus von neuem - beide Doppelstränge werden zu nun vier Einzelsträngen aufgeschmolzen und erneut zu vier Doppelsträngen ergänzt usw.

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Abb.1
Der zyklische Ablauf einer PCR

(1) Im ersten Schritt der PCR wird das doppelsträngige DNA-Template geschmolzen, so dass zwei zueinander komplementäre Einzelstränge entstehen. (2) Kurze Oligonucleotide, die komplementär zu den Einzelstrang-DNAs sind und den gewünschten DNA-Bereich flankieren, binden an die entsprechenden Bereiche auf der Einzelstrang-DNA. Sie begrenzen damit den Bereich, der im weiteren Prozess vervielfältigt (amplifiziert) werden soll. Die DNA-Polymerase bindet an das freie 3'-Ende dieser Primer und verlängert das DNA-Stück so lange, bis das Ende des Templates erreicht ist. In diesem Schritt entsteht also wieder eine doppelsträngige DNA aus den vorherigen Einzelsträngen. Durch eine Temperaturerhöhung werden das ursprüngliche Template und das neu synthetisierte Produkt nun wieder voneinander getrennt; ein neuer Zyklus kann beginnen.

Verwendet man in diesem Prozess eine temperaturstabile Polymerase (z.B. die Taq-Polymerase), die nicht während des Schmelzvorgangs denaturiert, wird das Template so lange exponentiell vermehrt, bis die Menge an Substrat erschöpft ist.

Übung

1)DNA: Desoxyribonucleinsäure
2)RNA: Ribonucleinsäure
3)komplementär: sich gegenseitig ergänzend
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