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Klonierung

Vektoren

Definition
Vektoren (Plasmide, Phagen oder Viren) dienen der Klonierung von rekombinanter DNA.

Neben den Klonierungsvektoren wurden bei den Plasmid-Vektoren weitere Typen für spezielle Fragestellungen konstruiert. Dazu zählen:

  1. Expressionsvektoren Diese enthalten einen starken, meist regulierbaren Promotor. Hinter diesem liegt in Transkriptionstrichtung eine oder mehrere singuläre Schnittstellen für Restriktionsenzyme, in die Gene einkloniert werden können.
  2. Bifunktionelle Vektoren (Shuttle-Vektoren) Diese Vektoren, die durch die Fusion von zwei Plasmiden entstehen, können sich in mindestens zwei Spezies replizieren. Diese Art von Vektor wird immer dann benutzt, wenn man eine Klonierung oder andere in vitro - Manipulation in E. coli durchgeführt hat und dann das ausgereifte Konstrukt in eine andere Wirtszelle einschleusen möchte.

Virale Vektoren und Bakteriophagen

Als Klonierungsvektor in Bakterien wird häufig der Bakteriophage λ verwendet. Dabei handelt es sich um einen temperenten E. coli-Phagen, der sich unter geeigneten Bedingungen in das Genom der bakteriellen Wirtszelle integrieren kann. In diese Vektoren lassen sich relativ lange DNA-Fragmente (bis zu 23 kb) klonieren, da nur 60 % der λ-DNA für die Phagenvermehrung essenziell sind. Über in vitro-Verpackung werden die rekombinanten λ-DNA-Moleküle in die Wirtszellen eingebracht. Bei λ-Insertionsvektoren wird das zu klonierende Fragment ins Genom eingefügt, während bei den Substitutionsvektoren ein internes Fragment gegen das zu klonierende Fragment ausgetauscht wird. Auch der filamentöse Phage M13 lässt sich als Klonierungsvektor einsetzen.

Abb.1
DNA des λ-Phagen als Substitutionsvektor am Beispiel von EMBL3

Ein beträchtlicher Teil des λ-Genoms ist für die Phagenvermehrung entbehrlich. Dieser Bereich kann durch Fremd-DNA ersetzt werden. Eine Reihe von λ-Derivaten tragen geeignete Schnittstellen, die die einfache Entfernung des entbehrlichen Abschnitts ermöglichen.

Viren dienen als Vektoren zur Transfektion tierischer Zellen, aber im Gegensatz zu den Bakteriophagen haben Tierviren keine nicht-essenziellen Regionen. Werden essenzielle Gene durch Fremd-DNA substituiert, sind die Viren nicht mehr vermehrungsfähig und benötigen zur lytischen Vermehrung ein Helfer-Virus. Wichtige Viren, die als Vektoren dienen, sind z.B. SV40 (repliziert in Affenzellen), das Adenovirus (repliziert nur in menschlichen Zellen) und die RNA-haltigen Retroviren.

Für die Einbringung von Fremd-DNA in Pflanzenzellen werden Pflanzenviren und das Ti-Plasmid aus dem Bakterium Agrobacterium tumefaciens als Vektor genutzt. Die Pflanzenviren sind als Vektor noch wenig erforscht, über das Ti- System ist jedoch mehr bekannt. Da die T-DNA des Ti-Plasmids fest in die chromosomale DNA der Pflanzenzelle eingebaut wird, muss das zu klonierende Gen in die T-DNA eingebracht werden. Allerdings tauchen dabei Schwierigkeiten auf, da die Ti-Plasmide sehr groß sind und die meisten Restriktionsschnittstellen mehrmals auftauchen.

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