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Klonierung

Plasmide

Alle Plasmid-Vektoren leiten sich von natürlichen Plasmiden ab.

Definition
Plasmide sind bakteriellen Ursprungs und vermehren sich eigenständig in einer Zelle, sie besitzen also die Eigenschaften eines Replikons. Die Replikation von Plasmiden ist unabhängig von der zellulären DNA-Replikation und kann auf zwei verschiedenen Arten kontrolliert werden.
  • Stringente Replikationskontrolle: Plasmid-Replikation und Replikation der Wirts-DNA sind eng miteinander gekoppelt. Diese Plasmide kommen in der Zelle in geringer Zahl (1-2 Kopien) vor und werden als low copy number-Plasmide bezeichnet.
  • Relaxierte Replikationskontrolle: Die Plasmide replizieren vollständig unabhängig von der Wirts-DNA. Sie liegen in hohen Kopienzahlen von 10-200 in der Zelle vor und werden als high copy number- oder multicopy-Plasmide bezeichnet. Bei high copy number-Plasmiden liegt die Kopienzahl per Definition über 20.

Konjugative und mobilisierbare Plasmide

Plasmide können aufgrund ihrer Fähigkeit zur Übertragbarkeit von einer Zelle in die andere in zwei Klassen eingeteilt werden: konjugative und mobilisierbare Plasmide.

Zur Übertragung sind so genannte Transfergene (tra) und Mobilisierungsgene (mob) verantwortlich. Die tra-Gene codieren für den Sex-Pilus, der Kontakt mit der Rezipientenzelle aufnimmt. Die mob-Funktion ist durch zwei Genbereiche charakterisiert, von denen einer für das Mobilisierungsprotein codiert. Dieses bindet an eine DNA-Region auf dem Plasmid und führt an dieser Stelle zu einem Strangbruch. Dieser DNA-Bereich wird als nic/bom Stelle bezeichnet (nic = Einzelstrangbruch; bom für basis of mobility). Plasmide, die sowohl tra- als auch mob-Gene enthalten, werden als konjugative Plasmide bezeichnet (z.B das F-Plasmid). Plasmide ohne tra-Gene sind nicht-konjugativ, ihnen fehlt die Transferfunktion. Unter Mithilfe eines anderen in der Zelle vorhandenen konjugativen Plasmids können jedoch auch nicht-konjugative Plasmide von einer Zelle auf die andere übertragen werden. Dieses Phänomen wird als Mobilisierung eines Plasmids bezeichnet.

Plasmide in der Gentechnologie

Plasmid-Vektoren, die in der Gentechnologie eingesetzt werden, fehlt aus Sicherheitsgründen (Schutz vor unkontrollierter Übertragung der DNA) die nic/bom-Stelle und die mob-Gene. Diese Vektoren müssen folgende weitere Eigenschaften besitzen:

  1. Autonome Replikation in der Bakterienzelle und damit Besitz eines origin of replication (Replikationsursprung).
  2. Besitz eines selektierbaren Marker wie z.B. einer Antibiotikaresistenz.
  3. Besitz eines Multilinker-Bereiches. Dieser Bereich trägt eine Reihe von Restriktionsendonuclease-Schnittstellen zum Einklonieren der DNA-Fragmente.
  4. Häufig ist es erwünscht, dass die Kopienzahlen hoch sind. In solch einem Fall muss die Replikation unter relaxierter Kontrolle stehen.
Abb.1
Allgemeine Struktur von Plasmiden

Nicht-konjugative und konjugative Plasmide unterscheiden sich durch Ab- bzw. Anwesenheit der Transferfunktionen ( tra ).

Natürliche Plasmide können diese Kriterien nicht erfüllen. Daher wurden schon früh in der Gentechnologie künstliche Plasmidvektoren entwickelt wie z.B. pBR322 oder dessen Derivate, die pUC-Vektoren.

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