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Klonierung

Cosmide

Cosmide1) sind Klonierungsvektoren, die eine Kombination zwischen einem Plasmid und den cos-Stellen aus dem λ-System darstellen. Diese cos-Stellen sind einzelsträngige, überhängende DNA-Bereiche an den Enden des linearen Genoms des Phagen λ, die sich in der Wirtszelle zu einem Ring schließen können. Die Anwesenheit der cos-Stellen ermöglicht es, dass Cosmide in vitro in Phagenköpfe verpackt und so mit hoher Effizienz in Bakterienzellen eingeführt werden können.

In der Molekulargenetik sind Cosmide für den Aufbau von Genbanken wichtig, da relativ große Fremd-DNA-Fragmente von mehr als 40 kb aufgenommen werden können. Cosmide selbst haben nur eine Länge von 4-9 kb. Bei dem Zusammenbau der Phagen werden nur solche DNA-Moleküle in die Phagenköpfe verpackt, die mit ihren cos- Stellen eine Länge von 37-51 kb aufweisen. Für eine erfolgreiche Infektion der Bakterienzellen ist also die Aufnahme der Fremd-DNA notwendig.

Ein Einsatz von Cosmiden hat Vorteile: Zum Einen ist die Klonierung von großen Genen oder ganzen Gengruppen einfacher, da die Klonierungskapazität von Cosmiden größer ist als die von Plasmiden. Zudem bedeutet der Einsatz von Cosmiden für die Herstellung von DNA-Banken, dass eine geringere Anzahl von Klonen untersucht werden muss, da diese Klonierungsvektoren größere DNA-Fragmente enthalten.

Abb.1
Das Prinzip eines Cosmid-Klonierungssystems

Das Cosmid trägt einen E. coli-Replikationsursprung (ori), mit dessen Hilfe sich das Cosmid als Plasmid in E.coli vermehren kann. Daneben trägt das Cosmid zwei cos-Stellen, die eine singuläre ScaI-Schnittsequenz flankieren. Die Einklonierung der Fremd-DNA erfolgt über die singuläre Schnittstelle einer Restriktionsendonuclease, in diesem Falle Bam HI, mit dem das Cosmid und die zu klonierende DNA geschnitten wird. In die Ligation werden nur Fremd-DNA-Fragmente von ca. 40 kb eingesetzt, da der Abstand der beiden cos-Stellen zueinander ca. 50 kb betragen muss, um stabil in die Phagenköpfe verpackt zu werden. Bei der in vitro-Verpackung werden die verknüpften DNA-Moleküle in λ-Köpfe geschleust. Unter Zugabe vorgefertigter λ-Schwänze entstehen infektiöse Partikel. Während der in vitro-Verpackung werden die cos-Enden gespalten, so dass überhängende cos-Sequenzen entstehen. Die infektiösen λ-Partikel schleusen das linearisierte DNA-Molekül in die E. coli-Zellen ein. In der Wirtszelle paaren die cos-Enden und ermöglichen den Ringschluss der linearen DNA. Diese zirkuläre Form ist stabil, denn der Vektor verfügt über sämtliche notwendigen Plasmidfunktionen. Das Tetracyclin-Resistenzgen ermöglicht dann eine Selektion der transformierten Zellen.

1)Das Wort Cosmid ist aus den Bezeichnungen cos und Plasmid entstanden.
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