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Bakteriengentechnik

Klonierung

Definition
Als Klonierung wird die Integration eines Gens oder DNA-Fragments in einen Klonierungs- bzw. Expressionsvektor sowie die nachfolgende Vermehrung und Expression dieser rekombinanten DNA in einem geeigneten Wirtssystem bezeichnet.
Abb.1
Grundlagen des Klonierens

Als Transfersystem für die rekombinante DNA dienen Vektorsysteme. Ein Vektor kann entweder nur ein Träger-Molekül für die Fremd-DNA sein oder den Gen-Transfer selbstständig durchführen. Bei der Klonierung werden Vektor- und Fremd-DNA mit einer Restriktionsendonuclease geschnitten, vermischt und durch die Ligase wieder zu Ringen vereinigt.

Je nach Zielsetzung werden eukaryontische oder prokaryontische Wirtssysteme eingesetzt. Das Paradebeispiel für prokaryontische Wirtssysteme ist das Bakterium Escherichia coli, während die Hefe Saccharomyces cerevisiae das meistgebräuchliche eukaryontische Wirtssystem ist. Im Allgemeinen können Expressionsanalysen bestimmter Operons nur innerhalb der gleichen Ordnung durchgeführt werden, diese Einschränkung gilt aber nur bedingt für die Synthese heterologer Proteine. Besondere Schwierigkeiten entstehen hier oft bei der Expression von eukaryontischen Proteinen in Bakterien (die sich im Gegensatz zu den eukaryontischen Zellen leichter kultivieren lassen), da eukaryontische Proteine im Gegensatz zu prokaryontischen Proteinen oft im posttranslational modifiziert werden. Die Modifikationen müssen dann anschließend enzymatisch eingeführt werden.

Expressionsuntersuchungen tierischer und pflanzlicher Zellen werden an einem breiten Spektrum an Spezies durchgeführt. Die Produktion von heterologen Proteinen in tierischen oder pflanzlichen Wirtssystemen erfolgt größtenteils in Zellkulturen anhand etablierter Zelllinien. Auch der Einsatz transgener Tiere zur Produktion von heterologen Proteinen wird in verschiedenen Pilotprojekten untersucht.

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