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Quantitative Bestimmung von Vitamin C

Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)

Die Flüssigkeitschromatographie (LC) ist eine auch für nichtflüchtige organische Substanzen (wie die Ascorbinsäure) geeignete spezifische Trennmethode, die ohne aufwendige Probenbehandlung durch Silylierung auskommt. Einzige Voraussetzung ist die Löslichkeit der Probe in einem Lösungsmittel (flüssige mobile Phase!). Moderne HPLC-Analysen sind innerhalb weniger Minuten durchführbar.

Eine Optimierung der HPLC-Trennungen kann durch Variation der Säulendimension, des Säulenfüllmaterials (chemische Oberflächenkonstitution, Korngröße, Porencharakteristik) und vor allem der Eluentenzusammensetzung und des Flusses erreicht werden.

Trennverfahren

In der Nahrungsmittelanalytik und in der Klinischen Chemie werden Vitamin C-Bestimmungen mit den verschiedenen HPLC-Trennverfahren an unterschiedlichen Säulen durchgeführt. Die Methodenauswahl richtet sich vor allem nach der jeweiligen Probenbeschaffenheit (Matrix), der Konzentration des Analyten in der Probe und den analytischen Anforderungen und Erfahrungen.

Abb.1
HPLC-Trennverfahren bei Vitamin C - Analysen

Detektion

Die Empfindlichkeit der Analysen hängt hauptsächlich von dem verwendeten Detektionssystem ab.

Tab.1
Detektion bei HPLC- Analysen von Vitamin C
UV/VIS-Detektor - Ascorbinsäure-Absorption bei 265 nm (pH-neutral) - pH-Kontrolle erforderlich - Dehydroascorbinsäure ist direkt nicht nachweisbar (zu geringe Absorption)
Fluoreszenz-Detektor - Derivatisierung der Dehydroascorbinsäure mit o-Phenylendiamin zu einem fluoreszierendem Produkt - Ascorbinsäure wird mit Thiosulfat, Kupferchlorid, Ascorbinsäureoxidase o.ä. oxidiert, dann erst derivatisiert - Ermittlung des Ascorbinsäure-Gehaltes nur durch Differenzbildung der Messergebnisse möglich
Elektrochemische Detektion - Oxidationsreaktion an einer Glaskohlenstoff- oder Graphitelektrode - Interferenzen durch elektrochemisch aktive Kontaminanten - aufwendiges technisches Equipment

Weit verbreitet sind UV/VIS-Detektoren, aber auch Fluoreszenz- und elektrochemische Detektoren können eingesetzt werden. Damit werden sehr geringe Nachweisgrenzen erreicht.

Durch Zugabe eines Reduktionsmittels (meist Homocystein) wird sichergestellt, dass der Gesamt-Vitamin C-Gehalt der Probe (Ascorbinsäure und Dehydroascorbinsäure) vollständig erfasst wird. Das wird vor allem notwendig, wenn verarbeitete Lebensmittel, medizinische Proben und andere Matrices untersucht werden, in denen eine Oxidation der Ascorbinsäure bereits stattgefunden haben kann. Frisches Obst und Gemüse enthalten keine Dehydroascorbinsäure.

Hinweis
Trotz der recht guten Abtrennung interferierender Substanzen weist auch die Anwendung der HPLC bei der Vitamin C-Analyse Probleme auf, wenn beide Komponenten (die oxidierte und die reduzierte Form) bestimmt werden sollen!

Dehydroascorbinsäure

Der sehr geringe Extinktionskoeffizient des intensivsten UV-Signals der Dehydroascorbinsäure (bei 210 nm) kompliziert deren Nachweis durch die HPLC mit UV-Detektion. Dazu kommt, dass die Dehydroascorbinsäure (DHAS) in biologischen und natürlichen Proben meist im Vergleich zur Ascorbinsäure in wesentlich geringerer Menge vorhanden ist. Ihre Erfassung erfordert daher zusätzlichen technischen und/oder präparativen Aufwand.

In der Praxis werden folgende Methoden angewendet:

  • indirekte Erfassung durch Differenzbildung a) Reduktion der DHAS zum Ascorbat (z. B. mit Homocystein) und Bestimmung des Gesamtascorbat-Gehaltes b) Bestimmung ohne vorherige Reduktion (ausschließlich reduzierte Form) c) Ermittlung der DHAS-Konzentration durch Differenzbildung der Messergebnisse
  • Derivatisierung der Dehydroascorbinsäure (z. B. mit 1,2-Phenylendiamin) vor oder nach der Trennung und anschließende Detektion des gebildeten Derivates (so gelingt bei gut entwickelter Methode auch die simultane Bestimmung beider Komponenten)
  • Kopplung mehrerer Säulen zur Verbesserung der Auflösung

Die (parallele) Bestimmung der Einzelkomponenten des Gleichgewichts, die Verfolgung von Veränderungen des natürlichen Verhältnisses in Gewebeproben oder Körperflüssigkeiten und der Nachweis weiterer Folgeprodukte der Vitamin C-Zersetzung (inklusive der Radikal-Zwischenform) stellen höchste Anforderungen an die HPLC-Analytik und stehen weiterhin im Mittelpunkt von Forschungsarbeiten.

Dagegen ist die Handhabung der HPLC für Ascorbinsäure-Bestimmungen in Lebensmitteln, Arzneimitteln und Diätprodukten vergleichsweise einfach. Hier stellt die Instabilität des gelösten Vitamin C das Hauptproblem dar.

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