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Quantitative Bestimmung von Vitamin C

Beispiele für UV/VIS- bzw. Fluoreszenz-Spektroskopie

Nachweis der Ascorbinsäure mit Tillmans Reagenz und UV/VIS-Spektroskopie

Der Redoxindikator 2,6-Dichlorphenolindophenol (DCPIP), der als Tillmans Reagenz bekannt ist, wird bis heute für Vitamin-C-Bestimmungen verwendet. Es ist ein dunkelgrünes Pulver, das sich in Wasser und Ethanol leicht löst. DCPIP-Lösungen sind im alkalischen Bereich blau, im sauren Bereich rosa gefärbt.

Durch Ascorbinsäure wird DCPIP reduziert und geht dabei in seine farblose Leukoform über (Abb. 1) . Dieser Farbumschlag kennzeichnet die erfolgte Redoxreaktion. Er bildet die Basis der volumetrischen Vitamin-C-Bestimmung, die lange die Methode der Wahl für die Vitamin-C-Bestimmung war. Der Nachweis ist wenig spezifisch: Stoffe mit ähnlichem Reduktionsvermögen wie die Ascorbinsäure werden ebenfalls erfasst und täuschen so einen zu hohen Vitamin-C-Gehalt vor.

Abb.1
Chemischer Nachweis von L-Ascorbinsäure mit Tillmans Reagenz

Die Reduktion des DCPIP verursacht im UV/VIS-Spektrum eine Verringerung der Absorption des DCPIP bei 520nm. Die Messung erfolgt im sauren Bereich (pH 3,5 - 4), um die Störung durch oxidierte Folgeprodukte der Ascorbinsäure gering zu halten.

Tab.1
Vor- und Nachteile
VorteileNachteile
einfache, schnelle Durchführung keine Probenvorbehandlung leichte Auswertung geringe Gerätekosten, weite Verbreitung der UV-Spektrometer geringe Empfindlichkeit geringe Spezifität (Miterfassung von Thiolen, Phenolen, Reduktonen u.a.) Interferenzen durch Metallkationen (Fe3+,Cu2+,Sn4+) und Sulfit-Ionen

Nachweis der Ascorbinsäure mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin

Abb.2

Reagiert Ascorbinsäure mit der gelben 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Lösung, bildet rötliches Hydrazon.

Die Methode nach Roe und Osterling erlaubt die gemeinsame Bestimmung von Ascorbinsäure und Dehydroascorbinsäure, wobei eventuell vorkommende Erythorbinsäure (Isoascorbinsäure) ebenfalls erfasst wird. Der Nachweis basiert auf einer Kondensationsreaktion, die sich optisch durch den Farbumschlag der gelben Lösung des 2,4-Dinitrophenylhydrazins (schwefelsauer) verfolgen lässt (Abb. 2) . Das bei der Reaktion gebildete Hydrazon weist eine rötliche Färbung auf.

Die Ascorbinsäure wird dabei zunächst zu Dehydroascorbinsäure oxidiert. Dehydroascorbinsäure (ebenso ihr Folgeprodukt 2,3-Diketogulonsäure) reagiert mit 2,4-DNPH unter Bildung eines Bis-2,4-Dinitrophenylhydrazons, das in schwefelsaurem Milieu löslich ist und dessen Absorption bei 520nm die Basis für die quantitative Bestimmung anhand des VIS-Spektrums ist (Abb. 3) .

Abb.3
Chemischer Nachweis von Dehydroascorbinsäure mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin

Mit dieser Methode sind die einzelnen Ascorbinsäure-Spezies in Abhängigkeit von der Reaktionsführung bestimmbar. Wird die Probe nur stabilisiert, aber nicht oxidiert, reflektiert die Messung nur den Gehalt an Dehydroascorbinsäure und 2,3-Diketogulonsäure. Die Zugabe eines Oxidationsmittels (z.B. Br2) bewirkt die Oxidation der Ascorbinsäure zur Dehydroascorbinsäure und diese wird zusätzlich erfasst.

Abb.4
Schema

Nachweis verschiedener Ascorbinsäure-Spezies in Abhängigkeit von der Reaktionsführung

Durch sinnvolle Kombination der Probebehandlung vor der Messung und Subtraktion der Messergebnisse sind Ascorbinsäure- und Dehydroascorbinsäure-Gehalt einer Probe getrennt bestimmbar.

Eine unvollständige Oxidation der Probe und/oder eine ungenügende Stabilisierung (insbesondere bei biologischen Proben, die Metallspuren enthalten) führen zu Fehlern, welche die Genauigkeit des Nachweises erheblich beeinträchtigen. Einige Zucker, Aminosäuren und Thiosulfate verursachen Interferenzen. Diese Störungen können durch hohe Verdünnungen verringert werden, jedoch sinkt dadurch die Spezifität des Nachweises.

Tab.2
Vor- und Nachteile
VorteileNachteile
allgemein anwendbar wenig störungsanfällig leicht durchführbar vergleichsweise hohe Spezifitätaufwendig, wenn alle Spezies bestimmt werden sollen (viele Reaktionsschritte) Interferenzen durch andere Reduktone, Zucker und Aminosäuren
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