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Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)

Injektion in der HPLC

Injektion bedeutet die Einbringung der Probe in den fließenden Eluentenstrom (mobile Phase). Die Probe wird dann mit der mobilen Phase auf die Säule transportiert. Es gibt 2 verschiedene Probenaufgabesysteme, die für die HPLC folgende Anforderungen erfüllen müssen:

Anforderungen

  • exakt definiertes Volumen der Probe
  • reproduzierbare Einbringung
  • kein Unterbrechen des Eluentenstroms
  • einfach zu handhaben
  • kleines Totvolumen - kaum Bandenverbreiterung
  • für hohe Drücke geeignet
  • Volumen veränderbar
  • chemisch inert

Die Probemenge hängt ab von

  • der Empfindlichkeit des Detektors
  • der Verdünnung durch das Verweilen im chromatographischen System
  • der Beladbarkeit der stationären Phase (Säulenmaße)

Septuminjektion

Abb.1

Die Probe wird mit einer Spritze durch ein Septum hindurch in den Probenstrom gebracht. Das Septum befindet sich in einem Injektionsblock. Es besteht meist aus Silikongummi, da sich das Einstichloch wieder zusammenziehen soll, wenn die Nadel der Spritze zurückgezogen wird. Gegen den hohen Druck sind Hochdruckspritzen erforderlich.

Dosierschleifen / Mehr-Wege-Ventile

Dosierschleifen ermöglichen das reproduzierbare Einbringen von definierten Injektionsvolumina in das HPLC-System. Sie bestehen meist aus einem 6-Wege-Ventil, das in zwei Stellungen die verschiedenen Funktionen ausführt:

Abb.2
Load-Stellung

Die Probe wird in die drucklose Schleife mit der Spritze gefüllt. Man benutzt einen Volumenüberschuss (3-5fach), um die Schleife zu spülen und gleichmäßig zu füllen. In dieser Stellung fließt durch die 2 anderen Wege im Ventil der Eluent direkt zur Säule. Gleichgewichte und Druck werden dadurch konstant gehalten.

Abb.3
Inject-Stellung

Die Lage der Öffnungen im Ventil wird gewechselt, so dass der Eluent durch die Schleife fließt und dabei die Probe zur Säule schiebt. In dieser Zeit steht die Schleife unter Druck

Vorteile der Dosierschleife:

  • durch Auswechseln sind Schleifengrößen von 1-1000 µl einsetzbar
  • Volumen ist sehr gut reproduzierbar
  • das Injizieren gegen Druck ist reproduzierbar möglich
  • automatisierbar
  • auch für präparative Mengen geeignet

Die Injektion in der HPLC ist auch in automatisierter Form in Benutzung, wobei die Dosierschleife von einem Autosampler gefüllt wird.

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