zum Directory-modus

Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)

Gradienten in der HPLC

Die Zusammensetzung der mobilen Phase entscheidet wesentlich über:

  • Analyten, die in einem HPLC-System getrennt werden können
  • Analysenzeiten

Bei isokratischer Elution (d.h. gleichbleibender Zusammensetzung) von Analyten-Mischungen werden die zuerst eluierten Komponenten stark gedrängt erscheinen, während die stärker retardierten Komponenten breite, späte Peaks liefern ("allgemeines Elutionsproblem"), die sogar im Grundrauschen des Detektors untergehen können.

Dieses "allgemeine Elutionsproblem" kann durch die Verwendung eines Lösungsmittelgradienten gelöst werden. Hierbei werden bewusst Unterschiede der Elutionskraft der Lösungsmittel genutzt und damit zu jeder Zeit den zu eluierenden Substanzen angepasst. Der Grad der Änderung der Elutionskraft bzw. der Anteil eines Lösungsmittels mit der Zeit wird als Gradient bzw. Lösungsmittelgradient bezeichnet.

Das Mischen der Lösungsmittel erfolgt entweder vor der Pumpe drucklos ("Niederdruck-Gradient") oder nach der Pumpe unter Hochdruck ("Hochdruck-Gradient").

Tab.1
Gradienten-Typen
Niederdruck-GradientHochdruck-Gradient
Vorteile - konstante Flussrate (Kompressibilitäts-Feedback) - Anschluss beliebig vieler Vorratssysteme - geringer apparativer Aufwand (Magnetventile, Mischkammer und Steuergerät) - billig - einfache Bedienung - flexibel - automatisierbar - kurze Ansprechzeiten - exaktere Mischungsverhältnisse
Nachteile - Abweichungen im Mischungsverhältnis durch verzögerte Ansaugphase/Totvolumen der Pumpe (unterschiedliche Kompressibilität der Lösungsmittel; Volumenkontraktion beim Mischen) - Flussrate ist von der Volumenkontraktion abhängig - teurer - hoher apparativer Aufwand (pro Lösungsmittel separate Hochdruckpumpe; Ultraschallschwinger zum Mischen unter hohem Druck) - Mischgenauigkeit sinkt bei kleinen Flussraten/niedrigen Mischungsverhältnissen
Optimierungsziel
Das Ziel der chromatographischen Trennung ist, eine effektive Peakauflösung in möglichst kurzer Zeit zu erreichen.

Die Optimierung des Gradienten ist der maßgebliche Schritt, der über den Erfolg einer Trennung in der HPLC entscheidet. Durch verschiedene Lösungsmittelzusammensetzungen des Eluenten können gezielt Verteilungskoeffizienten und damit Kapazitätskoeffizienten beeinflusst werden. Der Gradientenverlauf ist meist linear oder zusammengesetzt linear, aber auch konkav oder konvex. Die Laufzeiten können außerdem noch durch möglichst hohe Flüsse verkürzt werden, da die Trennung von den Gradientenvolumina abhängt.

Abb.1
mögliche Gradientenverläufe
Seite 6 von 35