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Datenauswertung Chromatographie

Peakhöhe oder Peakfläche?

Quantitativ kann das vom Detektor erzeugte Analyt-Signal, also der Peak, über die Bestimmung der Peakhöhe oder der Peakfläche erfolgen. Prinzipiell sind sowohl die Höhe als auch die Fläche des Peaks von der Konzentration bzw. der Masse des Analyten abhängig. Jedoch ist dieser Zusammenhang nicht immer proportional.

Peakhöhe

Die Peakhöhe gibt die Entfernung der Basislinie zum Maximum des Peaks an. Bei gut aufgelösten Peaks ist die Peakhöhe zur Konzentration des Analyten proportional.

Abb.1
Peakhöhe

Zur quantitativen Auswertung über die Höhe eines Peaks, ist es erforderlich, für jede Komponente eine Kalibrierung durchzuführen, da die Peakhöhe von der Retentionszeit abhängt. Außerdem sind Aussagen möglich zur:

  • groben Abschätzungen der Konzentrationsverhältnisse
  • Analyse von Gasgemischen, wenn direkt das Probevolumen gegen die Höhe kalibriert werden kann
  • Prozesschromatographie

Abb.2
Schlecht aufgelöste Peaks

Die Auswertung über die Peakhöhe sollte nicht bei unsymmetrischen Peaks erfolgen und führt bei zwei Peaks, deren Auflösung schlechter als ca. 1,25 ist zu Schwierigkeiten. Weitere Bedingungen sind:

  • die Zusammensetzung der mobilen Phase darf sich während der Messung nicht ändern
  • Änderungen des Volumenstromes bzw. der Fließgeschwindigkeit spielen dagegen eine geringe Rolle

Peakfläche

Bei gut aufgelösten Peaks ist die Peakfläche zur Konzentration des Analyten proportional. Im Gegensatz zur Peakhöhe liefert die Peakfläche auch bei unsymmetrischen Peaks genaue Ergebnisse.

Abb.3
Peakfläche

Die Bestimmung der Fläche kann mit verschiedenen Verfahren erfolgen. Heute überholte Varianten sind das Ausschneiden der Peaks und anschließendes Wägen, das Auftragen der Peaks auf Millimeterpapier und Auszählen der einzelnen Kästchen und das Planimetrieren (Bestimmung des Peakumfanges mit einem Planimeter).

Im Allgemeinen erfolgt die Bestimmung der Peakflächen heute durch Approximationen, deren Grundlage verschiedene Näherungen bilden:

Dreiecksmethode: Näherung - ideale Gauß-Kurve (also symmetrische Peaks)

Abb.4
Dreiecksmethode

Der Peak wird als Dreieck betrachtet. Wichtige Voraussetzung ist, dass der Peak annähernd Gauß-verteilt ist. Geringe Unsymmetrien an der Peakbasis werden ausgeglichen, indem die Peakfläche über: A = h b 50 % berechnet wird. Diese Methode hat sich in der Praxis bewährt, da das Ergebnis der berechneten Fläche nur um ca. 6 % vom Integrationsergebnisse der Gauß-Kurve abweicht.

Retentionszeit - Näherung: Bestimmung von b 50 %

Abb.5
Retentionszeit-Näherung

Zwischen der Retentionszeit t r und der Peakbreite in halber Höhe besteht ein fast linearer Zusammenhang. Dieser kann genutzt werden, um die Peakbreite in halber Höhe zu bestimmen, wenn eine schlechte Auflösung eines Peakpaares dies direkt nicht zulässt und Peakhöhenbestimmung nicht erfolgen soll.

Die Peakfläche wird dann nach der Dreiecksmethode bestimmt.

Näherung für unsymmetrische Peaks nach Condale-Bosch:

Abb.6
Unsymmetrische Peaks

Die Flächenbestimmung des Peaks erfolgt mit Hilfe der Peakbreiten bei 15% der Peakhöhe ( b 15 % ) und bei 85 % der Peakhöhe ( b 85 % ) nach folgender Formel:

K = h b 15 % + b 85 % 2

Diese Flächenberechnung lässt sich auch auf ideale Gauß-Kurven anwenden, jedoch sollten die Peaks gut getrennt sein.

Abb.7
Ungleiche Nachbarpeaks

Die Auswertung über die Peakfläche empfiehlt sich bei benachbarten Peaks mit sehr unterschiedlichen Maximalwerten, deren Auflösung geringer ist als 1,5 nicht. In solchen Fällen wird der Peak mit dem geringeren Maxima kleiner bestimmt und der größere Peak zu groß (Veranschaulicht ist dieser Fall im dargestellten Bild).

Integratoren

Übernehmen die Auswertung der Chromatogramme - nicht die Interpretation! Können Änderungen der Basislinie berücksichtigen und Peakflächen (auch schlecht aufgelöster Peaks) "richtig" auswerten.

Moderne Software für die Bearbeitung von Chromatogrammen ermöglicht eine weitgehend automatische Auswertung. Die Algorithmen der Interpretation der Peaks können bei unterschiedlichen Herstellern verschieden sein. Die Voraussetzung für Peakflächenbestimmungen ist aber stets die gewissenhafte Festlegung der Basislinie. Die Softwareentwicklung geht deshalb immer weiter auf die einzelne Verarbeitung der Peaks ein, so dass die Ergebnisse so unabhängig wie möglich von der Subjektivität des Analytikers werden. Mit den wachsenden Fähigkeiten der Rechentechnik wurde so die quantitative Auswertung der Chromatogramme, von einer einst aufwendigen, langwierigen und ungeliebten Tätigkeit mit starken subjektiven Fehlern, zu einer unauffälligen Hintergrundarbeit des Computers. Das darf aber nicht dazu verleiten, die Arbeit des Computers kritiklos hinzunehmen. Das Prüfen der Basislinien und Peakgrenzen kann bei komplexen Proben wesentliche Fehl-Interpretationen vermeiden!

Um Peaks in der Chromatographie über die Peakfläche auszuwerten, müssen folgende Bedingungen erfüllt sein:

  • die Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase spielt keine Rolle
  • Volumenstrom bzw. Fließgeschwindigkeit muss konstant sein
Hinweis
Weitere wichtige Hinweise für quantitative Analysen mittels Chromatographie sind:
  • die Probe sollte möglichst in dem gleichen Lösungsmittelgemisch gelöst werden, das auch als mobile Phase verwendet wird
  • die Säule darf nicht überladen sein
  • der Detektor sollte im linearen Bereich arbeiten
  • Temperaturkonstanz sollte gewährleistet sein
  • eindeutige Peakerfassung sollte möglich sein
  • es dürfen keine Peaküberlagerungen auftreten
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