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Grundlagen der Chromatographie

Die Totzeit

Das Totvolumen einer Säule entspricht dem Volumen an mobiler Phase, das zum Füllen aller Poren und Zwischenräume einer Säulenpackung benötigt wird. Dieses Totvolumen spielt in der Praxis aber weniger eine Rolle als das Totvolumen einer HPLC-Anlage im Ganzen.

Das Totvolumen einer HPLC-Anlage beschreibt das Volumen an mobiler Phase, das zum Füllen aller Hohlräume der Anlage benötigt wird. Dabei geht das Injektionsvolumen mit ein, aber auch das Volumen der Kapillaren, der Mischkammer, der Säulenpackung von Vorsäule und Säule und nicht zuletzt das Detektorvolumen. Dies sind alles Bereiche, in denen die Diffusion zur Verbreiterung des Probenpfropfens führt, ohne dass ein chromatographisches Trenngeschehen stattfindet. Deshalb ist man bemüht, dieses Totvolumen der Anlage so klein wie möglich zu halten.

Totzeit und Totvolumen hängen rechnerisch wie folgt zusammen:

t0 = V0 υ t0 - Totzeit V0 - Totvolumen υ - Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase

Über die Totzeit ist man bestrebt, das Totvolumen der Anlage zu bestimmen. Dabei muss man aber zwischen der experimentell zugänglichen Totzeit t0, exp und der wahren Totzeit t0, wahr unterscheiden, die nicht experimentell einfach zugänglich ist.

Abb.1
Experimentelle und wahre Totzeit im Chromatogramm

Die experimentelle Bestimmung der Totzeit t0, exp erfolgt, indem eine Substanz injiziert wird, die keine chemische Wechselwirkung mit der Säule aufnehmen kann. Ihre Retentionszeit im Chromatogramm wird als experimentelle Totzeit definiert.

Die wahre Totzeit ist die Zeit, die eine Substanz benötigt, um das HPLC-System ohne jegliche Wechselwirkung, also auch ohne Porendiffusion einem Konzentrationsgradienten folgend, zu passieren. Dies gilt nur für die mobile Phase. Die Poren sind mit mobiler Phase gefüllt; neue Moleküle der mobilen Phase, die mit der Fließgeschwindigkeit bewegt werden, finden den Weg in die Poren nur auf Grund Brown'scher Molekularbewegung, nicht aber durch einen Konzentrationsgradienten. Folglich bewegen sich die Moleküle im Durchschnitt mit der Fließgeschwindigkeit. Die Bewegung der mobilen Phase ist im Detektor aber nicht erkennbar. Dadurch ist die wahre Totzeit nicht so einfach messbar.

Wird nun eine Substanz injiziert, die keine Wechselwirkung chemischer Art mit der Säule aufnimmt, so muss sie sich aber trotzdem länger in der Säule aufhalten als die mobile Phase, weil sie erst noch dem Konzentrationsgradient folgend in die Poren hineinwandern muss. Deshalb ist die experimentell zugängliche Totzeit stets länger als die wahre Totzeit.

Eine beobachtbare Erscheinung, die dies bestätigt, erhält man, wenn man eine Substanz injiziert, die aufgrund ihrer Molekülgröße nicht in die Poren der Säule passt. Sie zeigt sich im Chromatogramm vor der experimentellen Totzeit. Die wahre Totzeit ist dann noch kleiner.

Totzeit
Als Totzeit wird die Retentionszeit bezeichnet, die die mobile Phase benötigt, um das chromatographische System von Injektion bis Detektion zu durchlaufen. Sie ist experimentell nicht zugänglich. Eine experimentell zugängliche Totzeit, die aber größer ist als die wahre Totzeit, erhält man durch Injektion und Detektion einer Substanz, die mit der Säule keine chromatographischen Wechselwirkungen aufnimmt, wohl aber ihren Weg durch die Poren der stationären Phase geht.
Abb.2
Verhältnisse in den Poren der Säule

Substanz A:

▪ mobile Phase ▪ bewegt sich durch die Säule mit Fließgeschwindigkeit ▪ bewegt sich in die Poren durch Brown'sche Bewegung, keinem Konzentrationsgefälle folgend ▪ bewegt sich mit der wahren Totzeit

Substanz B

▪ hat keine Möglichkeit zur Wechselwirkung ▪ klein genug, um aber in die Poren einzudringen ▪ folgt dem Konzentrationsgradienten in den Poren ▪ erscheint zur experimentellen Totzeit

Substanz C

▪ passt in die Poren ▪ nimmt Wechselwirkung auf, retardiert ▪ erscheint nach der Totzeit, Trenneffekt aufgrund von Wechselwirkungen

Die regelmäßige Prüfung der experimentellen Totzeit gibt dem Analytiker Aufschluss über die Konstanz der Bedingungen in der HPLC-Anlage. Zusätzlich auftretende Totvolumina z.B. durch Hohlräume in der Säulenpackung werden so schneller bemerkt.

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