zum Directory-modus

Chromatographie - kompakt

Das Prinzip der HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Definition
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie (abgekürzt HPLC von Abkürzung von englisch high performance oder high pressure liquid chromatography) ist eine analytische Trennmethode, bei der die stationäre Phase häufig fest ist, die mobile Phase flüssig. Der Unterschied zur normalen Flüssigchromatographie ist die hohe Trennleistung, die durch sehr kleine, druckstabile Packungsteilchen ( < 10µm), pulsationsarme Pumpen, hohe Drücke (bis 400bar), entsprechende Injektionssysteme und miniaturisierte Detektoren erreicht wird.

Die Bezeichnung Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography)ist eine sehr positivistische Interpretation oder Namensgebung der Chromatographie-Firmen - im Vergleich zur vorher üblichen Säulenchromatographie. Die Leistungsfähigkeit ist eigentlich eher eine Minimierung der HPLC-Gerätebestandteile mit den damit verbundenen neuen technischen Erfordernissen (hoher Druck) und der Möglichkeit sehr geringer Probemengen, gleichbleibend guter Trennleistung und einer Beschleunigung der Analyse. Die absolute Zahl möglicher trennbarer Verbindungen ist normalerweise weiter auf ca. 25 beschränkt.

Das P in der Abkürzung HPLC wurde aber auch noch mit anderen (humoristischen) Interpretationen belegt, z.B mit "price" wegen der anfangs hohen Anschaffungskosten.

Anforderung an die Probe

Die Probe mit dem Analyten muss vollständig löslich in einem als Eluent geeigneten Lösungsmittel sein.

Geräteaufbau allgemein

Mobile Phase - Eluenten

Der Trenneffekt in der HPLC beruht in den meisten Anwendungsfällen auf der unterschiedlichen Polarität von stationärer und mobiler Phase (Eluent). Deshalb hängt die Wahl des Eluenten eng mit dem Packungsmaterial der Säule zusammen. Zwei hauptsächliche Gruppen lassen sich unterscheiden:

  • Eluenten für die Chromatographie mit Normalphasen (NP): unpolare, wasserfreie Lösungsmittel z.B. Heptan, Hexan, Dichlormethan, Essigsäureethylester
  • Eluenten für die Chromatographie an Umkehrphasen (RP): polare Lösungsmittel z.B. Wasser, Methanol, Acetonitril

Die mobile Phase in der HPLC muss stets von gelösten Gasen befreit sein (Entgasung). In den gleichmäßigen Fluss wird die Probe injiziert und zur Säule transportiert.

Stationäre Phase - Säulen

In der HPLC hat die stationäre Phase die Form einer gepackten Säule. Das Füllmaterial ist für die Art und Stärke der Wechselwirkung verantwortlich.

Normalphasen

Normalphasen waren die ersten Chromatographiesäulen überhaupt. Sie erhielten ihren Namen, als ihre Polaritätsverhältnisse als "normal" definiert wurden im Gegensatz zu den neuaufgekommenen "unnormalen" Phasen, den Umkehrphasen. Normalphasen sind Kieselgele oder Aluminiumoxide, an denen reine Adsorptionsvorgänge an den polaren OH-Gruppen zur Trennung ausgenutzt werden.

Tab.1
Beispiel für Normalphasen
Chemischer Name (Kurzform)Aktive StrukturStruktur (schematisch)
Kieselgel SiO2

Umkehrphasen

Bei den Umkehrphasen (reversed phases, RP) sind die Polaritätsverhältnisse "umgekehrt" im Vergleich zu den Normalphasen. Unpolare Seitenketten sind an ein Kieselgelgerüst oder an ein Polymer gebunden. Dadurch verhalten sie sich hydrophob. Mit zunehmender Kettenlänge werden die Phasen unpolarer. Der Trennmechanismus basiert auf Van-der-Waals-Kräften. Je ähnlicher der Analyt der Kohlenwasserstoffkette der Phase ist, umso größer sind seine Wechselwirkungen mit der Säule.

Umkehrphasen werden heutzutage weit häufiger eingesetzt als Normalphasen, weil sie universell für polare und unpolare Analyten einsetzbar sind.

Tab.2
Beispiele für Umkehrphasen
Chemischer Name (Kurzform)Aktive StrukturStruktur (schematisch)
Octyl-Phase C8H17
Octadecyl-Phase C18H37
Phenyl-Phase C6H5

Daneben gibt es noch polare gebundene Phasen. Sie basieren ebenfalls auf Kieselgelen, an denen Ketten gebunden sind, die funktionelle Gruppen tragen. Dadurch sind diese Trennphasen in verschiedenen Graden polar. Beispiele hierfür sind Diol-, Amin- und Cyanphasen.

HPLC-Detektoren

Detektoren am Ende der Säule der HPLC-Anlage sind das entscheidende Bindeglied, um die analytische Information der chromatographischen Trennung messbar und dann sichtbar zu machen. Sie wandeln stets eine physikalische Information in elektrische Signale (Analogsignale) um. Man unterscheidet Detektoren, die auf die physikalischen Eigenschaften der mobilen Phase und des Analyten ansprechen bzw. nur auf den Analyten. In der HPLC häufig verwendete Detektoren sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Tab.3
häufig eingesetzte Detektoren in der HPLC
SinnbildDetektorspezifisch fürkleinste noch nachweisbare Menge (für ein Signal-Rausch-Verhältnis = 2)
UV/VIS-Detektorkonjugierte Doppelbindungen, Aromaten 100 pg mL-1
Fluoreszenzdetektorstarre Aromaten 0,1 - 1 pg mL-1
Refraktometrischer Detektor (RI)Zucker 0,1 μg mL-1
Elektroanalytischer Detektorelektrochemisch aktive Substanzen 10 pg mL-1
Seite 6 von 7