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Analyse eines Protein-Mikroschalters durch FTIR-Differenzspektroskopie

Versuchsaufbau

Um die Konformationsänderungen des Rhodopsins untersuchen zu können, wurden am IMPB1) in COS-Zellen2) das Protein und verschiedene Mutanten (vgl. Mutation) exprimiert. Dann entfernte die Arbeitsgruppe die Zellmembran durch Detergenzien und reinigte das Rhodopsin von den Zellrückständen. Um es unter möglichst natürlichen Bedingungen untersuchen zu können, wurde es dann in eine künstliche Membran (Phosphatidylcholin) eingebettet. Schließlich wurde in der Membransuspension der gewünschte pH-Wert eingestellt.

Die Probe wurde dann in die Messapparatur (Abb. 1) eingesetzt und das Spektrometer evakuiert, um Störungen durch Wasserdampf im Strahlengang zu vermeiden. Da die gewünschten Meta-Zustände nicht nur pH- sondern auch temperaturabhängig sind, wurden die Proben entsprechend temperiert (z.B. auf 0°C, um den Meta-I-Zustand zu erhalten). Dann wurde ein FTIR-Spektrum aufgezeichnet. Anschließend wurde die Probe durch LED mit Licht der Wellenlänge 500nm bestrahlt, um eine Konformationsänderung des Proteins zu induzieren. Schließlich konnte das zweite Spektrum aufgezeichnet werden. In der Animation (Abb. 1) ist dieser Prozess vereinfacht dargestellt.

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Abb.1
Animation zur Veranschaulichung der Messungen an Rhodopsin

In der Animation ist die Spektrenaufzeichnung von Rhodopsin im Dunkelzustand und des Meta-I-Zustandes dargestellt. Um andere Meta-Zustände zu untersuchen, werden andere Temperaturen (und pH-Werte) eingestellt. Durch Mausklick auf den Knopf "i" werden Beschriftungen der einzelnen Komponenten angezeigt.

1)IMPB: Institut für Medizinische Physik und Biophysik der Berliner Charité
2)COS ist die Abkürzung für CV1 Origin SV40. Es handelt sich um eine Zelllinie, die sich von der Affennierenzelllinie CV1 ableitet.
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